کشت سلول و بافت گیاهی

دستور العمل کاربردي کشت سلول و بافت گیاهی

مقدمه

وقتی درباره کشت گیاه صحبت می شود معمولاً منظور کشت گیاهان در گلدان، زیر پلاستیک، گلخانه و یا مزرعه می باشد. تکثیر رویشی که شامل قلمه زدن، خوابانیدن و پیوند زدن می باشد از دیرباز در کشاورزي اهمیت داشته و از آن در تکثیر گیاهان زراعی، درختان میوه و … استفاده می شود. البته روشهاي تکثیر رویشی در شرایط طبیعی در برخی موارد کارآمد نبوده و روش جدیدي از کشت گیاهان، تحت عنوان کشت سلول و بافت گیاهی معرفی و ارائه شده است. کشت سلول و بافت گیاهی که با عنوان کشت درون شیشه ( invitro) و یا کشت استریل نیز مطرح می شود و در مورد تمام انواع کشتهاي استریل که در شرایط درون شیشه اي انجام می گیرد ، به کار می رود. در حال حاضر تکنیکهاي کشت بافت به عنوان ابزاري قوي جهت مطالعه مشکلات اساسی و کاربردي بیولژي گیاهی در آمده است. علاوه برآن در سالهاي اخیر این تکنیک ها کاربردهاي تجاري گسترده اي در تکثیر گیاهان مختلف از جمله گیاهان زینتی و دارویی و نیز حذف عوامل بیماریزا از گیاهان پیدا نموده است. علاقه مندي به کشت بافت و توانایی آن در اصلاح گیاهان به صورت یک موضوع جهانی درآمده است و افزایش تعداد کشورهاي عضو شرکت کننده در موسسه بین المللی کشت بافت گیاهی گواهی براین ادعا می باشد . علاوه بر آن هیئت بیولوژي گیاهی موسسه تحقیقات سلولی یونسکو (ICRO) ، آموزش تکنیک هاي کشت بافت گیاهی را به عنوان یکی از برنامه هاي اولویت دار خود معرفی کرده است و تدریس تکنیکهاي کشت بافت جزو برنامه درسی دانشجویان رشته هاي داروسازي ، پزشکی، کشاورزي، گیاهشناسی، زیست شناسی، جنگلداري و. …. درآمده است.

تاریخچه

اولین بار در سال 1838 اشلیدن و شوان تئوري Totipotency را ارائه نمودند. براساس این تئوري ، هر یک از سلولهاي یک موجود پرسلولی اگر در شرایط مطلوب محیطی قرار بگیرند توانائی تکامل و تبدیل شدن به یک موجود کامل را دارند. بعدها این تئوري به عنوان اساس مطالعات در زمینه کشت بافت قرار گرفت. اساس تئوري کشت بافت گیاهی توسط هابرلنت فیزیولژیست شهیر آلمانی در سال 1902 پیشنهاد گردید. وي اظهار داشت طبق مطالعاتی که اینجانب انجام داده ام، مطالعه سیستماتیک سازمان یافته اي روي کشت سلولهاي رویشی ایزوله شده گیاهان عالی انجام نشده است. او بر روي سلولهاي ایزوله فتوسنتزي برگ و سلولهاي متفاوت دیگر آزمایش کرد که ناموفق بود. با این وجود اظهار داشت که می توان به طور موفق جنین هاي مصنوعی حاصل از سلولهاي رویشی را کشت کرد. بنابراین او به طور واضح نظریه توتی پتانسی را بیان نمود و نشان داد که تکنیک کشت سلولهاي ایزوله گیاهی در محلول غذایی، روش آزمایشی جدیدي براي بررسی مسائل مهم است. براساس تحقیقات او در سال 1902 (و بعد از آن) ، هابرلنت به عنوان پدر کشت بافت گیاهی نام گرفت. پس از آن در سال 1907 اولین کشت سلولهاي حیوانی و انسانی انجام شد اما در کشت سلولهاي گیاهی پیشرفتی وجود نداشت تا اینکه در سال 1955 هورمون کینتین کشف شد و به دنبال این کشف، کشت سلولها و بافتهاي گیاهی رونق گرفت به طوري که در سال 1958 تعداد آزمایشگاههاي کشت بافت گیاهی در آمریکا و کانادا به بیش از 250 رسید که در هر آزمایشگاه سالانه بیش از یک میلیون گیاه تولید می گردد. این رقم در سال 1985 براي هر 18 آزمایشگاه سالانه به 60 میلیون گیاه رسید. پیشرفت مهم دیگري که در سال 1962 صورت گرفت معرفی و تولید محیط کشت MS (موراشیگ و اسکوگ) بود. این محیط یکی از بهترین محیط هاي کشتی است که امروزه نیز کاربرد دارد. براي آشنایی بیشتر در مورد تاریخچه کشت سلول و بافت می توان به موارد ذیل اشاره نمود:

•    1902: اولین کوشش در کشت بافت گیاهی توسط هابرلنت.
•    1904 : اولین کوشش براي کشت جنین از بعضی گیاهان خانواده شب بو توسط هانیگ.
•    1922: کشت درون شیشه نوك ریشه توسط رابین.
•    1934: کشت موفقعیت آمیز ریشه هاي گوجه فرنگی توسط وایت.
•    1936  : کشت بافت بازدانگان مختلف توسط دارو.
•    1939: کشت موفق ومداوم کالوس توسط گوتره، نوبه کورت و وایت. :
•    1950: باززائی اندامها از بافتهاي کالوس درسکویا توسط بال.
•    1960: تکثیر رویشی ارکیده به وسیله کشت مریستم توسط مورل.
•    1962: تولید محیط کشت معروف موراشیگ و اسکوگ  ( MS ) توسط موراشیگ واسکوگ.
•    1964: تولید اولین گیاه تاتوره هاپلوئید از کشت دانه گروه توسط گها و شوواري.
•    1969: اولین جداسازي موفق پروتوپلاست از کشت سوسپانسیون Hapopappus توسط اریکسون و جانسن.
•    1974 : انتقال بیولژیکی در کشت بافت گیاه توسط رین هارد.
•    1985: آلودگی و انتقال قطعات برگ بوسیله اگروباکتریوم و باززائی گیاهان انتقال یافته توسط هدرج و همکاران.

خصوصیات آزمایشگاه کشت سلول و بافت

تعیین محل آزمایشگاه کشت بافت، تصمیم مهمی است. آزمایشگاه نباید در مجاورت آزمایشگاه هایی که از میکروارگانیسم ها و یا حشرات استفاده می کنند یا محل ذخیره بذر و مواد گیاهی هستند، تأسیس شود زیرا انتقال آلودگی از طریق دریچه هوا و رفت و آمد زیاد، مسئله ساز می گردد . رفت و آمد زیاد موجب بالارفتن غبار از کف زمین شده و به گسترش آلودگی کمک می کند. ازقراردادن گلدان حاوي گیاه در فضاي آزمایشگاه کشت بافت اجتناب شود چون می توانند منبعی از کنه ها و سایر موجودات آلوده کننده دیگر باشد. بلافاصله بعد از پایان کار در مزرعه یا گلخانه، نباید وارد آزمایشگاه شد زیرا احتمال ورود کنه و حشرات چسبیده به مو یا لباس به داخل آزمایشگاه وجود دارد.

تجهیزات آزمایشگاهی

تجهیزات و وسایل لازم براي یک آزمایشگاه کشت بافت به شرح زیر است:

•    اتوکلاو، از این وسیله براي استریل کردن محیط هاي کشت و وسایل شیشه اي استفاده می شود.

•    دستگاه لامینار ایرفلو یا هود استریل ، مولد هواي استریل می باشد. هنگام کشت ، گیاه را زیر هود استریل کشت دهید.
•    مواد شیمیایی، منظور محیط هاي کشتی است که براي کشت استفاده می شود. محیط هاي کشت معموماً داراي عناصر ماکرو و میکرو، ویتامین، هورمون ، قند و آگار می باشد ( پس از تهیه محیط pH آن بین 5-7 باشد )
•    دستگاه آب مقطرگیري
•    آون (فور)، وسایل فلزي توسط این دستگاه استریل می گردد.
•    اتاقک رشد یا Growth chamber ، در این اتاقکها از لامپهاي آفتابی و مهتابی استفاده شده و دما طوري تنظیم می گردد که تا حدود 25 درجه سانتیگراد باشد (با استفاده از تایمر می توان فتوپرید مناسب را براي هر گیاه را ایجاد نمود).
•    Hot Plate Magnet  ، در تهیه محیط کشت از این دستگاه استفاده شود.
•    ترازوي حامل، حساسیت آن باید  از 0.001  باشد تا موادي با مقادیر کم (مانند هورمونها) را نیز بتوان وزن کرد.
•    شیکر ، در کشت مایع از آن استفاده می شود.
•    PH متر
•    مواد لازم براي استریل کردن جداکشت، محیط کشت و ابزار کار (شامل هیپوکلریت سدیم و الکل اتیلیک (%70 )
•    منبع گاز دستگاه لامینار
•    یخچال و فریزر

اتاقک استریل (دستگاه لامینار ایرفلو)

گرچه آماده سازي و قطع قلمه ها، قطعات کالوس و غیره، در یک ظرف شیشه اي و یا در بین فیلتر کاغذي استریل انجام می شود، ولی انجام این کار در اتاقک استریل ضرورت دارد. هنگامی که اعمال فوق در یک فضاي غیراستریل انجام شود میزان آلودگی افزایش چشمگیري می یابد، حتی اگر از کاغذ استریل جهت کار استفاده شود. اتاقک استریل محلی است که هواي مکیده شده از خارج قبل از ورود به آن ، با عبور از فیلترهاي بسیار ریز، تصفیه می شود. این سیستم تصفیه جریانی از هواي استریل ایجاد می نماید، همچنین به منظور ضدعفونی خشک از چراغ الکلی یا چراغ گازي استفاده می شود.

کلیاتی در مورد استریل کردن

استریل کردن شامل استریل مواد گیاهی ( جداکشت ها ) ، محیط کشت و ابزار مورد مصرف در کشت سلول و بافت می باشد. در مورد مواد گیاهی یا جداکشت ها، ابتدا سطح اندامی که قرار است به عنوان جداکشت استفاده شود (مثل شاخ و برگ یا ریشه….) را با مایع ظرفشویی شسته و به خوبی آب کشی کرده سپس جداکشت مورد نظر را تهیه و در محلول هیپوکلریت سدیم (وایتکس) قرار می دهیم. باتوجه به نوع گیاه و نوع جداکشت ، تیماري که براي استریل کردن استفاده می کنیم ، متفاوت است. به این معنی که غلظت محلول هیپوکلریت سدیم و زمان قرار دادن جداکشت در آن بسته به نوع گیاه متفاوت است (باید توجه نمود تا نمونه تیره نشود). لازم به توضیح است که جداکشت یا   Explant  ( به قطعه اي از گیاه که در محیط کشت قرار می گیرد گفته می شود) را می توان از تمام قسمتهاي یک گیاه اعم از سیستم انتهاي ساقه، برگ، ساقه، ریشه و … بدست آورد. از دیگر مواردي که نیاز به استریل کردن دارد، محیط هاي کشت می باشد. پس از تهیه محیط کشت دلخواه آن را در شیشه هاي درب دار (شیشه هاي سس مایونز شیشه هاي مناسبی است چرا که هزینه کمی هم دربر دارد) ریخته و در اتوکلاو استریل نمایید.
توجه: درب شیشه هاي حاوي محیط کشت استریل تنها باید هنگام کار در زیر دستگاه لامینار (اتاقک استریل) باز شود. استریل کردن ابزار کار نیز از جمله مواردي است که باید رعایت گردد. ابزار فلزي مورد نیاز از جمله دسته تیغ یا قیچی و پنس را داخل فویل آلومینیوم پیچیده و در آون با حرارت 200 درجه سانتیگراد به مدت یک ساعت استریل کنید. ظروف پتري را نیز می توان مشابه ابزار فلزي استریل نمود. هورمونها و برخی ویتامینها که به دماي بالا حساس هستند را بعد از استریل شدن محیط کشت و در زیر دستگاه لامینار با استفاده از فیلترهاي غشایی به محیط کشت اضافه نمائید.

Heat Therapy ، تیمارگرمائی

تیمار گرما براي خلاصی از عوامل آلودگی در گیاه استفاده می شود. یکی از مهمترین عوامل آلودگی، ویروسها می باشند. گیاهان و ویروسها واکنش یکسانی به تیمار گرمایی نشان نمی دهند اما باید تعادلی به وجود آید که هم به گیاه اجازه رشد داده شود و هم بیشترین میزان حذف ویروس را داشته باشیم . همانطور که می دانیم در شرایط رشد طبیعی به موازات رشد انتهایی ساقه، ویروس نیز به بافتهاي جدید منتقل می شود. اگر گیاه بتواند در درجه حرارتهاي بالا رشد کند، در این صورت احتمال کاهش سرعت همانند سازي ویروس وجود دارد و در نتیجه انتهاي ساقه می تواند سریع تر از ویروس رشد کرده و عاری از ویروس گردد. سپس می توان انتهاي ساقه را که عاري از ویروس است، قطع و آن را کشت نمود. دمایی که معمولا استفاده می شود 36 تا 37 درجه براي چند روز (تا 7 روز) در ماه است. استفاده از برخی مواد شیمیایی در محیط کشت نظیر Ribavirin نیز منجر به تولید گیاه عاري از ویروس می گردد.

محیط کشت و ترکیبات آن

انتخاب محیط کشت براي موفقیت در کشت بافت ضروري است . هیچ محیط کشت مشخصی را نمی توان براي رشد انواع سلولها توصیه کرد و اغلب لازم است تغییراتی در محیط کشت براي پاسخگویی انواع مختلف جداکشت صورت گیرد. مسیر تعیین یک محیط کشت به هدف کشت سلول و بافت بستگی دارد. به طور کلی محیط کشت حاوي نمک هاي غیر آلی و ترکیبات آلی مثل تنظیم کننده هاي رشد، ویتامینها، کربوهیدراتها و یک عامل ژله اي کننده محیط می باشد، علاوه بر این محیط کشت می تواند داراي اسید آمینه و آنتی بیوتیک نیز باشد.

اجزاي محیط کشت بافتهاي گیاهی به شرح زیر است:

الف) نمک هاي غیرآلی و مواد معدنی
براي رشد بافتهاي گیاهی کشت شده ، تأمین مداوم بعضی از ترکیبات شیمیایی معدنی در محیط کشت ضروري می باشد. کربن، هیدروژن، اکسیژن، فسفر، پتاسیم، کلسیم، منیزیم و نیتروژن به مقادیر نسبتاً زیادي براي رشد و نمو بافتهاي گیاهی ضروري می باشد. نیتروژن که بیشتر از سایر عناصر مورد استفاده می باشد به صورت نیترات یا یون آمونیاك و یا ترکیبی از آنها به محلول غذایی افزوده می شود. سولفات منیزیم نیاز محیط کشت به دو عنصر منیزیم و گوگرد را تأمین می کند . فسفر را می توان به صورت فسفات منو سدیک و یا فسفات منو پتاسیک به محیط کشت اضافه کرد. به منظور تأمین کلسیم می توان از کلرور کلسیم یا نیترات کلسیم استفاده نمود.

از فرمولاسیون موراشیگ و اسکوگ (MS) به طور گسترده اي استفاده می شود و هدف از تهیه این محیط کشت ( که به مقدار نمک هاي آن توجه خاصی شده است) آن است که نشان دهیم اضافه نمودن عصاره بافت هاي گیاهی (که قبلاً به محیط کشت اضافه می شد)؛ رشد سلولی در کشت درون شیشه را افزایش نمی دهد و مواد غذایی غیر آلی معادل، محدود کننده رشد سلولی نیستند.

ب) تنظیم کننده هاي رشد
تنظیم کننده هاي رشد ( یا هورمونها) ترکیبات آلی هستند که به طور طبیعی در گیاهان عالی ساخته میشوند, و بر روي رشد و نمو اثر می گذارند. در کشت درون شیشه گیاهان عالی، نقش تنظیم کننده هاي رشد ( و از همه مهمتر اکسین ها و سیتوکسین ها) بارز می باشد و در اغلب موارد کشت درون شیشه بدون حضور تنظیم کننده هاي رشد غیر ممکن است . باید دانست اضافه کردن هورمون به محیط کشت بستگی به نوع قلمه و  گونه گیاهی دارد . به عنوان مثال قلمه هایی که خود اکسین کافی تولید می کنند، به اکسین اضافی براي رشد و تقسیم سلولی نیاز  ندارند.
اکسین ها:
این هورمون باعث رشد طولی سلول ، تقسیم سلولی ، تشکیل ریشه هاي نابجا و ممانعت از تشکیل شاخه هاي نابجا و جانبی می گردد. در غلظت هاي پایین اکسین، تشکیل ریشه هاي نابجا تحریک شده در حالیکه در غلظت هاي بالاتر کالوس زایی تحریک می گردد. از مهمترین اکسینهائی که به میزان زیادي در کشت بافت استفاده می شود ایندول بوتیریک اسید (IBA) می باشد. این اکسین در محیط کشت به موقع تجزیه می شود (اکسین ها باید حداکثر پس از 5 روز در محیط کشت تجزیه شوند) از دیگر اکسین هاي رایج می توان از ایندول استیک اسید یا IAA (زودتر از حد معمول در محیط تجزیه می شود)، نفتالین استیک اسید یا NAA (دیرتر از حد معمول در محیط کشت تجزیه می گردد) و 2 و 4 دي کلروفنوکسی استیک اسید ( D – 4 و  2 )   براي القاي کالزایی و از IAA، IBA و NAA براي ریشه زایی استفاده می گردد.
سیتوکنین ها:
کینتین، بنزیل آدنین (BA)، زآتین،  2 ایزوپنتیل آدنین ( 2ip) از پر مصرف ترین سیتوکینین هایی هستند که در محیط هاي کشت گیاهی به کار می روند. این هورمونهاغالباً براي تحریک رشد و نمو به کار می روند. سیتوکینین ها در غلظت کم  ( 0.1 میلی گرم در لیتر) باعث تولید کالوس و در غلظتهاي  بیشتر  (   1 – 10  میلیگرم در لیتر) ، شاخه زایی را تحریک می نمایند.
اسید جیبرلیک:
این گروه شامل حدود 60 ترکیب است که GA 3  رایج ترین آنها در گیاهان است. اسید جیبرلیک به ندرت در کشت بافت استفاده می شود. نقش اسید جیبرلیک عموماً در تحریک جوانه زنی بذر و تحریک رشد طولی میانگره هاست . به طور کلی اثر این هورمون در محیط هاي کشت ، تحریک طویل شدن شاخساره هاي خیلی کوچک و تحریک تشکیل جنین روي کالوس می باشد.
اسید آبسیزیک  ABA :
این تنظیم کننده یکی از مهارکننده هاي رشد محسوب شده اما در کشت بافت در تحریک نمو جنین از کالوس نقش دارد و از آن به ندرت در جنین زایی سوماتیک استفاده می شود.
اتیلن:
از این هورمون در کشتهاي invitro جهت جوانه زدن و تمایز سلولهاي چوبی استفاده می شود.

ج) ویتامینها
ویتامین ها نقش کاتالیزوري در سیستم هاي آنزیمی داشته و در محیط هاي کشت گیاهی فقط به مقدار بسیار جزیی مورد نیاز هستند. مهمترین ویتامینی که در محیط هاي کشت سلولی از آن استفاده می شود نیاسین (B1 ) می باشد . برخی از ویتامین هاي دیگر که در تهیه محیط کشت از آنها استفاده می شود شامل نیکوتینیک اسید یا نیاسین (B3  ) ، پیریدوکسین (B 6 ) ، اسید آسکوربیک (Vit c)، اسید فولیک و ریبوفلاوین (B 2 ) می باشند.

د) کربوهیدارتها
جداکشتها از نظر فتوسنتزي فعال نبوده و به یک منبع کربن ( که ساکارز یا گلوکز می باشد) نیاز دارند.

ه) عامل ژله اي کننده
اغلب آزمایشهاي کشت بافت برروي بستري ثابت صورت می گیرد و به طور معمول از یک عامل مولد ژل جهت این کار استفاده می شود . این عامل مولد ژل می تواند آگار (تهیه شده از نوعی جلبک دریایی)، ژلرایت (پلی ساکاریدي کامل از تخمیر گونه اي پسودوموناس) و یا فایتوژل (حاصل تخمیر آگار توسط گونه اي پسودوموناس) باشد.

تهیه explants یا جداکشت

گیاهی که از آن به عنوان جداکشت استفاده می شود باید سالم، بدون بیماري و آفت باشد . گیاهی که خشبی نشده به کشت بهتر جواب می دهد. براي آنکه گیاه به مرحله بلوغ برسد ، 3 مرحله را باید طی کند:

الف) مرحله نونهالی یا Juvenity    
ب) مرحله انتقال یا بینابینی    
ج) مرحله بلوغ یا Maturity

از طرفی مسن شدن به دو گونه تعریف می شود:
•    مسن شدن سنی    Cronological aging
•    مسن شدن فیزیولژیک    Physiological aging
مسن شدن فیزیولوژیک در گیاهان مختلف فرق می کند ، مثلاً در گیاه گردو 10 سال طول می کشد تا پاجوش آن گل بدهد. خصوصیات گیاه در هر یک از 3 مرحله بالا در طی کشت بافت فرق می کند  ، مثلاً اگر گیاه در مرحله نونهالی باشد به راحتی ریشه می دهد. لازم به ذکر است هر چه سن گیاه کمتر باشد و از قسمتهاي جوان گیاه جداکشت تهیه شود، کشت بافت آن موفق تر است.

انواع کشت

•    کشت سلول  Cell culture  : به کشت سلولها در محیط هاي مایع (بدون آگار) در ظرفهایی که معمولاً با تکان دادن تهویه می شوند، کشت سلولی گویند.
•    کشت پروتوپلاست : به سلولهاي گیاهی بدون دیواره سلولی، پروتوپلاست گفته می شود (دیواره سلولی با روشهاي مکانیکی یا شیمیایی از سلول جدا می شود.) از کشت پروتوپلاست براي ایجاد تغییرات ژنتیکی ، هیبریداسیون سلولی استفاده می شود. علیرغم وجود مشکلات تکنیکی که استفاده از پروتوپلاست را در پاره اي از مطالعات محدود کرده است، در حال حاضر از پروتوپلاست در زمینه هاي تحقیقاتی متعددي به شرح زیر استفاده می شود:
الف) ایجاد پیوند پروتوپلاستی بین دو یا چند سلول و تهیه گیاهان دورك با کشت پروتوپلاستهاي متحد شده، در برخی مواردي که به دلیل ناسازگاري جنسی و یا فیزیکی امکان تهیه گیاه دورگ با روشهاي ژنتیکی معمولی میسر نیست می توان با روش پیوند پروتوپلاست نسبت به ایجاد گیاهان دورگ اقدام نمود.
ب) وارد کردن موادژنتیکی خارجی به داخل سلول پس از حذف دیواره سلولی، پروتوپلاست مجزا شده می تواند با فرآیندي مشابه با فرآیند آندوسیتوز در بعضی از سلولهاي جانوري داخل مواد خارجی را به سیتوپلاسم جذب نماید. با اسفاده از این روش می توان اندامکهایی مانند کلروپلاست ، میتوکندري ، DNA، پلاسمید و … را وارد پروتوپلاست کرد.
ج) مطالعه نحوه سنتز و ترشح دیواره سلولی  پروتوپلاست کشت شده به سرعت دیواره سلولی تشکیل می دهد.
•    کشت گرده و تخمک : از این روش براي تولید گیاهان هاپلوئید در شرایط invitro استفاده می شود . هدف از کشت بساك یا گرده تولید گیاهان هاپلوئیدي از راه تحریک تولید جنین از تقسیمات دانه هاي گرده نابالغ می باشد. سلولهاي گیاهان هاپلوئید داراي مجموعه کاملی از کروموزمهاي تکی است . کروموزمهاي منفرد این هاپلوئیدها را می توان با استفاده از کلشی سین به صورت دوبل درآورد و در نتیجه دیپلوئیدهاي هموزیگوت بارور تولید می شوند. با استفاده از کلشی سین گیاه 2n را می توان  n4 کرد.
•    کشت تک جوانه   Single node  : منظور از کشت تک جوانه ، جداکردن یک جوانه به همراه قسمتی از شاخه به منظور تشکیل ساقه از طریق نمو جوانه است. این روش طبیعی ترین روش تکثیر رویشی گیاهان در invitro می باشد . هر جوانه اي در محور برگ مشابه با جوانه نوك شاخه، می توان روي محیط کشت رشد داده شود.
•    کشت رأس شاخه   Shoot tip culture : رأس شاخه یا قسمت انتهایی ساقه در واقع شامل هر سیستم انتهایی ساقه همراه با چندین پریموردیوم برگهاي مجاور می باشد. از این روش براي تکثیر در سطح وسیع استفاده می شود.
•    کشت مریستم : تنها نقطه اي در گیاه که عاري از آلودگی ویروسی است، مریستم می باشد. چرا که سرعت و قدرت تقسیم در مریستم به حدي زیاد است که ویروسها فرصت تقسیم و رشد پیدا نمی کنند. کشت مریستم عمدتاً در گیاهان باغی مورد استفاده قرار می گیرد هر چند براي تعداد زیادي از گیاهان زراعی مثل سیب زمینی ، شبدر و تنباکو نیز از این روش استفاده شده است . گیاهان عاري از ویروس در برخی گونه ها مثل گیلاس ، تمشک و انگور نیز از طریق کشت مریستم به دست آمده است .
•    کشت اندام و بافت : به کشت اندامها و بافتهاي مختلف گیاهی نظیر بساك، تخمدان، آوند، ریشه …. در محیط هاي مغذي گفته می شود.
•    کشت کالوس(یا توده هاي سلولی تمایز نیافته) : کشت قطعات جدا کشت گیاهان بر روي محیط هاي حاوي آگار که منجر به تولید توده هاي سلولی آمورف (بی شکل) می گردد را کشت کالوس گویند. فرآیند ایجاد کالوس از یک قطعه گیاهی کشت شده را می توان به 3 مرحله تکاملی تقسیم کرد: اول شروع تشکیل کالوس، دوم تقسیم سلولی، و سوم تکثیر و تمایز سلولهاي کالوس. در مرحله تشکیل کالوس ، همزمان با آماده شدن سلولها براي تقسیم، متابولیسم سلولی افزایش می یابد. یکی از عمده ترین مشکلات استفاده از کشت کالوس، ایجاد تنوع می باشد. استفاده عمده کشت کالوس در جایی است که بتوان سلولهاي کالوس را از هم جدا نموده و آنها را جهت تمایز به جنین هاي سوماتیکی القاء نمود. از نظر ریخت شناسی این جنین ها شبیه جنین هاي بذري (زیگوتی) می باشند. اما برخلاف جنین هاي بذري ، جنین هاي سوماتیکی از لحاظ ژنتیکی شبیه گیاهان مادري می باشند. یعنی تفرق ژنتیکی وجود ندارد. نکته جالب توجه در این مورد، تولید بذر مصنوعی (سوماتیکی) می باشد که از طریق قرار دادن جنین هاي سوماتیکی در یک پوشش مناسب، تهیه می شوند.
•    کشت جنین : استعداد گیاهان گلدار براي تولید جنین به تکامل سلول تخم بارور شده محدود نبوده بلکه در بافتهاي رویشی کشت شده این گیاهان نیز می توان جنین ایجاد نمود. این پدیده براي نخستین بار در کشت سوسپانسیون سلولهاي هویج توسط استوارد (Steward) و همکارانش گزارش شده است. امروزه معلوم شده است که تولید جنین یک پدیده عمومی در گیاهان عالی بوده و در بافتهاي کشت شده بیش از 30  تیره گیاهی، تولید جنین از سلولهاي رویشی به طور تجربی میسر شده است.
•    کشت جنین نارس : کشت جنین نارس به دست آمده از بذور دو کاربرد اصلی دارد. در بعضی موارد ناسازگاري بین گونه ها یا ارقام، بعد از تشکیل جنین اتفاق می افتد و منجر به سقط جنین می شود. چنین جنین هایی را در حالت نارس و قبل از سقط شدن می توان خارج کرده و در شرایط درون شیشه اي آنها را رشد داد. در موارد دیگري ، به دلیل ریزش بذر پس از رسیدن و از دست رفتن آنها، بذر بالغ ایجاد نمی گردد یا اینکه بذور در حال تشکیل قبل از بلوغ توسط حمله آفات از بین می روند. کشت جنین نسبتاً ساده است. جنین، یک گیاه کامل مینیاتوري است لذا به تمایز مجدد نو ساقه یا ریشه نیازي نمی باشد.

باززائی (Regeneration)

تکنیک هاي کشت بافت گیاهی به اندازه اي پیشرفت کرده است که با اجراي آن می توان گونه هاي گیاهی را در شرایط درون شیشه باززائی و تولید نمود. سلولها، بافتها و اندامهاي مختلف انتخاب شده از گونه هاي گیاهی متعدد را می توان به طور موفقیت آمیزي کشت کرد و از آنها گیاهان کامل تولید نمود. بدون باززائی ، مطالعات رشد و تمایز ، تولید گیاهانی با اطلاعات ژنتیکی مختلف ، کشت بساك، تکثیر سریع گونه هاي گیاهی مطلوب ، حذف بیماریهاي گیاهی با استفاده از کشت مریستم و بسیاري از مطالعات مربوط به تنظیم کننده هاي رشد انجام پذیر نخواهد بود. باززائی و تولید گیاهان توسط کشت بافت را می توان به یکی از دو روش زیر انجام داد:

1.    رویانزائی سوماتیک، در اینجا اولین اصل، قطبی شدن سلول گیاهی است. به این صورت که تمامی واکوئل ها در یک قطب و تمامی میتوکندریها در قطب مقابل آن قرار می گیرند. از قطب بالایی که محل تجمع واکوئل هاست، شاخه و از قطب پائینی ریشه به وجود می آید. جنین زائی می تواند مستقیم یا غیر مستقیم باشد. در نوع مستقیم ، بدون تشکیل کالوس جنین زائی صورت می گیرد و در نوع غیرمستقیم، با تکشیل کالوس  رویانزائی صورت می گیرد.
2.    اندامزائی، در این روش گیاه بدون جنین زائی به اندامزائی می رود و باید دانست در کشت بافت اگر اندامی نظیر ریشه یا شاخه به وجود آمد، این اندام نابجاست چون از مریستم به وجود نیامده است.
توجه: قابل توضیح است که رویانزائی  سوماتیک با رویانزائی زیگوتی (تخمی) قابل مقایسه است ، به این صورت که در رویانزائی سوماتیک ، رویان از سلولهاي پیگیري یا جسمی به وجود می آید نه از سلول تخم.

کاربردهاي کشت بافت

در باغبانی
کاربرد هاي کشت بافت در باغبانی به شرح زیر است:

الف) ریز ازدیادي یا Micropropagation ، براي این کار باید مراحل زیر را طی کرد:
•    رفع آلودگی  Disinfection
•    نثبیت  Establishment
•    شاخه زائی
•     ریشه زائی    
•    سازگاري با محیط
اولین مرحله در کشت بافت رفع آلودگی است به این معنی که قطعه جداکشت باید سترون گردد. بهترین روش استفاده از هیپوکلریدسدیم (وایتکس) است که باتوجه به نوع جداکشت (نو شاخه- ساقه- برگ…) از رقتهاي مختلف وایتکس استفاده می شود. سپس نمونه را چند بار   ( 2  تا 3 بار) با آب مقطر استریل شستشو می دهیم. در ادامه نمونه ها را با کاغذ صافی استریل خشک کرده و در مرحله بعدي تثبیت جداکشت در محیط کشت انجام می گیرد. سپس ظروف نمونه هاي کشت شده را در اتاقک رشد قرار می دهیم (شدت نور و میزان دماي محیط در اتاقک رشد قابل تنظیم است). جداکشت پس از تثبیت در محیط شروع به شاخه زائی می کند . باید دانست که از همین شاخه ها نیز می توان به عنوان جداکشت استفاده کرد. معمولاً ماهی یک بار نمونه ها واکشت می گردند (یعنی محیط کشت آنها عوض می شود). دلایل واکشت کاري عبارتند از :
•    به دنبال کاهش غلظت مواد غذایی در محیط، توازن مواد تشکیل دهنده آن به هم می خورد.
•    با مصرف مواد غذائی، مواد دفعی و سمی در محیط کشت افزایش می یابد.
•    همانطور که می دانیم در محیط کشت اول اصولاً از سیتوکنین ها استفاده می شود (به علت تحریک تقسیمات سلولی) و به دنبال آن اگر هدف تمایز باشد، نمونه ها را به محیط هاي کشت داراي اکسین می بریم و با توجه به اینکه هورمونها گران قیمت هستند. آنها را در واکشت هاي بعدي و باتوجه به نیاز ، به محیط کشت اضافه می نمائیم.
•    براي تحریک ریشه زائی در نمونه هایی که به خوبی شاخه زائی کرده اند آنها را به محیط هاي غنی از اکسین می بریم. باید به این مسئله توجه داشت که تثبیت از سخت ترین مراحل کار است. پس از ریشه دار شدن گیاه می توان آن را به گلدان منتقل کرد. خاك گلدان باید از جنس پرلیت (خاك آتشفشانی) و پیت (خاك مردابی) باشد. نسبت پرلیت به پیت باید 3 به یک باشد. پس از شستشوي ریشه هاي گیاه و پاك کردن آگار موجود در سطح آن ، گیاه را به گلدان منتقل می کنیم. در ابتدا رطوبت محیط باید %100 باشد به همین دلیل در هفته اول بعد از انتقال باید روي گلدان سرپوشی قرارداد (ساده ترین کار گذاشتن یک لیوان یکبار مصرف شفاف روي گیاه است) .گیاه باید کم کم با محیط سازگار شود. همانطورکه می دانیم گیاهی که قبلاً در محیط کشت به سر می برده گیاهی هتروتروف بوده (از مواد غذایی محیط کشت استفاده می کرده است) که باید به گیاهی اتوتروف تبدیل شود (یعنی فتوسنتز کرده و قند تولید نماید).

ب) عاري سازي گیاهان از ویروس

 ج) تولید متابولیتهاي ثانویه : اگر در تولید گیاهان داروئی از روشهاي کشت بافت استفاده شود می توان گیاهانی تولید کرد که خواص داروئی بیشتري دارند به این ترتیب که به عنوان جداکشت از قطعاتی استفاده شود که متابولیتهاي ثانویه بیشتري تولید می کنند در نتیجه گیاهان باززائی شده حاصل، متابولیت ثانویه بیشتري تولید می نمایند.

 در اصلاح نباتات

سلولهاي گیاهان هاپلوئید فقط داراي یک سري کامل از کروموزمها بوده و کاربرد آنها در برنامه هاي اصلاح نباتات (که به منظور انتخاب صفات مطلوب اجرا می شوند) بسیار مفید واقع می گردد. فتوتیپ گیاهان هاپلوئید عبارت از تظاهر یک نسخه از اطلاعات وراثتی می باشد که در آن هیچ گونه نهفتگی صفات بوسیله ژنهاي غالب وجود ندارد.
کاربردهاي کشت بافت در اصلاح نباتات عبارت است از:

الف) تنوع سوماتیکی ( Somaclonal variation)
وقوع این پدیده از دیدگاه اصلاح نباتات مؤثر و مناسب است چرا که می توان سلولهائی با توانائی هاي خاص ایجاد کرده و کشت داد(به طور مثال می توان نمونه هاي مقاوم به خشکی ایجاد نمود).

ب) ایجاد دابل هاپلوئید
تکنیک هاي متعددي جهت دو برابر کردن عدد کروموزمی گیاهان هاپلوئید وجود دارد. از جمله باززائی با استفاده از روشهاي کشت بافت گیاهی ، که در این روش می توان از بافت برگ مسن گیاهان هاپلوئید استفاده کرد. از طرفی عدد کروموزومی را می توان با اضافه کردن کلشی سین به جنین یا گیاه هاپلوئید، دوبله کرد.

ج) نگهداري جرم پلاس ( Germ plasm  ) به حالت منجمد یا Cryopreservative
در سالهاي اخیر توجه زیادي به چگونگی ذخیره کردن جرم پلاسم شده است، چرا که عوامل گوناگونی از جمله هجوم آفات نباتی و پاتوژنها، شرایط اقلیمی ، ناسازگاریهاي محیطی و بلایاي طبیعی موجب نابودي جرم پلاسم می گردد . از طرفی بذر اکثر محصولات زراعی مهم تحت شرایط سیستم هاي متداول ، قوه نامییه خود را در مدت کوتاهی از دست می دهند. بنابراین با توجه به موارد بالا ضرورت وجود بانک ژن آشکار میگردد. در بانک ژن ذخایر ژنتیکی هر کشور حفظ و نگهداري میگردد. شرایط نگهداري جرم پلاسم باید به گونه اي باشد تا تقسیم سلولی در آن متوقف شود. براي نیل به این هدف مواد گیاهی باید در ازت مایع (-196) انبار شوند. نگهداري جرم پلاسمها در این دما براي مدت زمانی نا محدود امکان پذیر است. باید دانست که یخ زدن در ازت مایع از نوع شیشه اي است یعنی متابولیتهاي متابولیکی کاهش می یابد ولی در فریزرهاي معمولی، یخ زدن از نوع کریستالی است.

 د) تولید بذر مصنوعی Artificial seed
یکی از اهداف رویانزایی سوماتیک ، تولید بذر مصنوعی است . پس از آنکه یکی از سلولهاي پیکري (سوماتیک)، مانند سلولهاي پارانشیم  یا حتی قطعات رویان تخمی    به رویانزایی رفت ، مراحل تشکیل رویان را می گذراند (شامل مرحله پیش رویانی ، مرحله رویان گویچه اي ، مرحله تمایز سلولی و مرحله تشکیل رویان لپه دار). در مرحله رویان لپه دار، رویان را به کپسولهاي کوچکی که داراي محیط کشت و مهار کننده هاي رشد است، انتقال داده در این حالت به آن بذر مصنوعی گفته می شود. می توان به جاي مهار کننده هاي رشد، بذر ها را در سرما قرار داد. سرما مانع رویش رویان می گردد. پوشش روي بذرهاي مصنوعی از ماده اي ژله اي به نام آلژنیات سدیم است.

هـ) انتقال ژن و مهندسی ژنتیک
به مجموعه روشهایی که توسط آنها همانند سازي و ساخت قطعاتی از DNA انجام می پذیرد تا جهت مقاصد صنعتی ، پزشکی و تحقیقی مورد استفاده قرار گیرد، مهندسی ژنتیک گفته می شود. به دنبال موفقیت در انجام کشت بافت ، روشهاي انتقال ژن ابداع و به کارگرفته شد. دراین روشها، ژنهاي خاصی به یک سلول یا پروتوپلاست اضافه می گردد. به طور مثال با انتقال ژن مقاوم به سرما به گیاه، گیاهان مقاوم به سرما ایجاد می گردد. در تکثیر تجاري گیاهان زینتی یکی از کاربردهاي مهم کشت بافت گیاهی، سرعت بخشیدن به تکثیر رویشی گیاهان زینتی می باشد. با استفاده از تکنیک هاي کشت سلول، امکان تولید سریع گیاهان مشابه وجود دارد.

مراحل اصلی فرایند تکثیر درون شیشه (Invitro)

الف) تهیه کشت هاي استریل. این مرحله اغلب به دلیل آلودگی و تولید ترکیبات فنولی توسط جداکشت ، مشکل است با این حال در این مرحله باید تعداد مناسبی ریز نمونه زنده مانده و روي محیط کشت رشد کنند.
ب) تکثیر تعداد زیادي اندامک هوایی. عموما افزودن سیتوکینین، تولید اندامک هوایی از جوانه هاي جانبی موجود و یا جوانه هاي نابجاي برگ، ساقه یا دمبرگ ونیز تشکیل جنین هاي سوماتیکی را افزایش می دهد.
ج) انتقال گیاهان به خاك،عموماً از یک اکسین براي ریشه دار نمودن اندامک هوائی حاصل استفاده می شود. براي اکثر گیاهان این مرحله با قراردادن آنها در گلخانه در خاك گلدان انجام می گیرد.
د) قلمه هاي ریشه دار شده از لوله هاي آزمایش برداشته شده و آگار آنها به آرامی شسته می شود. این قلمه هاي ریشه دار شده در خاك گلدان با رطوبت بالا و در سایه کشت می شوند،معمولاً بعد از دو هفته می توان آنها را در شرایط نور بیشتر و رطوبت کمتر قرارداد.
در اغلب گیاهان ریز ازدیادي نسبت به روشهاي تکثیر مرسوم، مزیت دارد. سودمندي اصلی تکثیر غیر جنسی ، تولید گیاهان یکسان ژنتیکی از یک رقم می باشد. گیاهان مادري مطلوب را می توان انتخاب نمود و هزاران کلون یکسان از آنها تولید کرد. اهمیت این مسئله زمانی مشخص می شود که هدف تکثیر یک گل با رنگی خاص باشد. تکثیر از طریق بذر باعث تنوع رنگ خواهد شد. اما تکثیر غیرجنسی گیاه گل قرمز تنها تولید گیاهان گل قرمز می کند.

ریز ازدیادي در برخی نمونه هاي زینتی

دراین بخش روش کشت چند نمونه گیاه زینتی ، به عنوان الگو، ارائه شده است.

 ریز ازدیادي ژربرا    Micropropagation  Of Gerbera

جنس ژربرا از خانواده Compositae ، داراي حدود 30 گونه علفی و چند ساله می باشد،منشاً این گیاه جنوب و شرق آفریقا، شمال آمریکا و آسیا (نپال و منچوري) می باشد. دوره رویشی گیاه به حالت روزت 7 تا 26 برگی بوده و دوره زایشی که در نهایت منجر به تولید گل می گردد، به دنبال آن شروع میشود. اکثر واریته هاي تجاري از G .Jamesonii مشتق شده اند. تولید گلهاي شاخه بریده ژربرا از ابتداي قرن بیستم در فرانسه شروع شده و مناطق زیر کشت آن در اروپا از 140 هکتار در سال 1957 میلادي  ، به 600 هکتار  در سال 1986 افزایش یافته است. کشورهاي اصلی تولید کننده این گل در سال 1992 ، کشور هلند با 148 هکتار، ایتالیا با 120 هکتار ، آلمان 70 هکتار و فرانسه 30 هکتار می باشند. کاشت این گل در خارج از اروپا نیز گسترش یافته به طوري که در ژاپن 30 هکتار، و در کره و تایوان 50 هکتار از زمین هاي کشاورزي زیر کشت این گل می باشند.

روشهاي ریزازدیادي    
الف) ریز ازدیادي از طریق انشعابات جانبی:    
1.    مرحله استقرار یا Establishment از طریق نوك ساقه
ابتدا گیاه را در یک گلدان به نحوي که بخش هاي بالائی ریزوم با خاك پوشیده نشود کشت می دهیم و از آبیاري اضافی در طول چند روز اولیه استقرار گیاه جلوگیري می نماییم. سپس گیاه را از سطح خاك جدا و فقط برگهاي رشد نیافته انتها و نوك ساقه را باقی می گذاریم. پس از جداکردن هر قطعه به آرامی با برس نرم آن را تمیز می نماییم. 20 میلی متر انتهاي ساقه را با اسکاپل جدا و به محیط کشت تکثیر محتوي 2.5 میکرومول کینتین ،  2.5  میکرومول BA و  2.5 میکرومول IAA در فتوپرید 16-8 ساعت با شدت نور 60 µmol/m²/s به مدت 6-4 هفته در دماي 25 درجه سانتیگراد نگهداري می کنیم (محیط پایه، MS می باشد) . براي کشت گل آذین هاي نارس آنها را به مدت 30 ثانیه در اتانول %70 و بلافاصله 90 دقیقه در محلول هیپوکلریت  سدیم 1.5  درصد قرار می دهیم و در پایان، به مدت 45 دقیقه با آب مقطر استریل شستشو میدهیم. هر گل آذین را به 5 تا 10 قطعه جدا کشت تقسیم و به محیط کشت تکثیر محتوي 2.5 میکرومول KIN،  2.5 مول  BAو   2.5 میکرومول IAA به  مدت 12 هفته (مثل شرایط قبل ) قرار می دهیم.
2.    مرحله ریشه زایی
پس از جداسازي ، هر قطعه ساقه 2 برگی را به مدت 3 هفته همانند شرایط قبل به محیط 1.2  MS    حاوی 0.25 تا ا میلی مولار NAA یا 2.5  تا 7.5 میکرومول IBA یا  IAA ( بسته به نوع کلون) ، منتقل می کنیم. محیط محتوي IBA و NAA منجر به تولید ریشه هاي زیاد و کلفت می شود. در حالیکه در محیط حاوي IAA فقط چند ریشه نازك تولید می شود.
ب – تکثیر از طریق باززایی جوانه بعد از کشت در محیط تکثیر، برگها را به نحوي جدا کنید که جوانه هاي جانبی حفظ شوند. برگها را در تماس با محیط کشت تکثیر محتوي 10 تا 15 میکرومول BA و  0.5 تا  2.5 میکرومول NAA در بتري دیش قرار دهید. براي برگهايکاملاً توسعه یافته از محیط کشت حاوي 0.5  میکرومول TDZ استفاده کنید و پتري دیش ها را در شرایطی مشابه مراحل قبلی به مدت 4 تا 6 هفته قرار دهید. سپس کالوسهاي باززایی شده را به محیط کشت تکثیر دارای مقادیر هورمون کمتر یعنی 2.5 میکرومول Kin،  2.5 میکرومول BA و 2.5 میکرومول IAA منتقل کنید.

ریزازدیادي سیکلامن یا نگونسار    Micropropagation of Cyclamen Persicum

جنس سیکلاس از خانواده پامچال ، داراي 19 گونه می باشد که در مناطق مدیترانه و مجاور آن پراکنده اند. گیاهان این جنس داراي غده و گلهاي زیبا می باشد. امروزه فقط C.persicum به عنوان یک گیاه تجاري مورد استفاده قرار می گیرد. تکثیر انبوه با کشت بافت روش مناسب و مؤثري جهت تکثیر این گیاه می باشد.

روشهاي ریز ازدیادي
الف) باززائی گیاه از طریق جنین زائی بافتهاي دانه رست استریل
جداکشت اولیه در واقع دانه رست هاي استریل 7 هفته اي کشت شده روي محیط کشظت MS با 1.3 غلظت و محتوي %3 ساکارز می باشد که ابتدا به مدت 3 هفته در تاریکی و متعاقب آن 4 هفته در دوره نوري 16 ساعت نور و 8 ساعت تاریکی و دماي 20 درجه سانتی گراد رشد داده می شوند. جدا کشتهاي دمبرگ و غده روي محیط کشت MS محتوي %3 ساکارز و جداکشتهاي لپه و ریشه روي محیط کشت MS محتوي %6 ساکارز ، 5 میکرومول 2,4-D   و 0.5 میکرومول کینتین در 25 درجه سانتی گراد در تاریکی کشت می شوند. براي جنین زائی ، کالوس حاصل از جداکشتها را به محیط کشت MS بدون تنظیم کننده رشد منتقل کنید. براي ادامه رشد رویشی، گیاهچه ها را به محیط کشت MS با %3 ساکارز و 0.1  میکرومول کینتین منتقل نمایید.
ب) ریز ازدیادي از طریق اندام زائی به منظور اصلاح نژاد سیکلامن گل زرد
دانه رستهاي استریل جوان واجد یک لپه سبز زرد که از آمیزش بین واریته اي زراعی با گل زرد و سایر واریته ها به دست می آیند، جهت کشت انتخاب می شوند. از هر اندامی به جز ریشه ، به عنوان جداکشت می توان استفاده نمود ولی بهترین اندام بافت غده می باشد. براي تشکیل ساقه ، جداکشتهاي غده به هشت قطعه تقسیم می شوند و روي محیط کشت MS با 1.3 غلظت ، محتوي %3 ساکارز  و 1 میکرمول BA یا 0.1 میکروکول NAA و 1 میکرومول BA کشت می شوند. براي به دست آوردن گیاهچه، ساقه ها را به محیط کشت MS با 1.3 غلظت ، محتوي %3 ساکارز و  0.5 میکروکول NAA منتقل نمایید.

ریز ازدیادي میخک    Micropropagation of Dianthus

تولید میخک در کشور با مشکلاتی مواجه است که مهمتر از همه سالم نگه داشتن بوته در دوران گلدهی و عاري بودن گل از آفات و بیماریهاست. در گلخانه هاي قدیمی و سنتی ، تولید گل سالم و استاندارد ، مشکل به نظر می رسد. باتوجه به اینکه سرعت تکثیر میخک با روشهاي سنتی کم است و نیز امکان انتقال بیماریها و به خصوص ویروسها با روشهاي معمولی تکثیر وجود دارد و با عنایت به اینکه با روشهاي کشت درون شیشه اي ، امکان انتقال بیماریها حداقل بوده ، سرعت تکثیر بالا و در عین حال نیاز به مواد گیاهی به عنوان پایه هاي مادري ، حداقل می باشد لذا به دست آوردن محیط هاي کشت مناسب و ارزان قیمت براي تکثیر درون شیشه اي میخک لازم و ضروري به نظر می رسد.

روشهاي ریزازدیادي
جداکشتها از گیاهان مادر در حال رشد فعال جدا شده و با استفاده از هیپو کلریت سدم 2.5 درصد به  مدت 20 دقیقه ضدعفونی شده و سپس 3 بار و هر بار به مدت 10 دقیقه با آب مقطر استریل شستشو شدند.
سپس جداکشتها به محیط کشت MS پایه یا 20 گرم در لیتر ساکارز و 8 گرم در لیتر آگار منتقل شد. براي ریشه زایی اندامهاي هوایی تولید شده، از محیط کشت MS همراه با هورمون IBA استفاده شد . بهترین درصد باززایی در هر جداکشت در محیط پایه MS تغییر یافته حاوي 0.3 میلی گرم دو لیتر NAA و یک میلی گرم هر لیتر BAP به دست آمد. براي حذف آلودگی می توان از مریستم جهت کشت ، و هم چنین آنتی بیوتیکها و قارچ کشها استفاده کرد.

ریز ازدیادي ارکیده    Micropropagation of orchis

در تکثیر غیر جنسی ارکیده ها، بسته به نوع ارکیده از روش هاي قلمه زدن و تقسیم بوته (در روش سنتی ) و کشت بافت (در روشهاي امروزي) استفاده می شود. در ارکیده هاي نوع منوپودیال، از روش قلمه زدن و در ارکیده هاي سمپودیال ، از روش تقسیم بوته استفاده می گردد. در حال حاضر در اغلب ممالک ، از  روش کشت بافت به عنوان روشی معمول در تکثیر ارکیده ها استفاده می شود. مزایاي تکثیر ارکیده ها به روش کشت بافت به شرح زیر است:
•    تکثیر انبوه رقمها و هیبریدهاي ممتاز در کوتاهترین زمان در مقایسه با تکثیر به روش سنتی .
•    تولید گیاهان عاري از ویروس به طریقه کشت مرسیتم از گیاهان آلوده.
•    ایجاد ارقام جهش یافته مرغوب.
براي کشت بافت ارکیده از برگ، جوانه هاي جانبی و انتهایی ساقه و ریشه استفاده می شود. نتایج نشان می دهد که جداکشت هاي حاصل از جوانه هاي جانبی و انتهایی رشد بهتري دارند. محیط کشت استفاده شده MS  می باشد که براي جامد کردن آن از آگار به میزان 8 گرم در لیتر استفاده می شود.

ریز ازدیادي کاملیا    Micropropagation of Camellia Japonica

مهمترین عواملی که باعث گران بودن برخی از گیاهان زینتی می شود عبارتند از: کند بودن رشد گیاه ، بالا بودن هزینه تولید بذور هیبرید، عدم تولید بذرکافی توسط گیاه مادري و یا عدم امکان استفاده از بذر تولید شده به دلیل دگر گشن بودن گیاه ، در صورت مواجه شدن با چنین مشکلاتی ، اصلاح گران نباتات می توانند تکنیک هاي کشت بافت را به عنون یکی از ابزارهاي مطمئن مورد توجه قرار دهند.
تکثیر کاملیا جاپونیکا در ایران منحصراً از طریق قلمه صورت می گیرد. کندي رشد و سخت ریشه زائی این گیاه دست به دست هم داده مانع از تکثیر آن در مقیاس انبوه می گردد. بدین معنی که حتی در صورت ریشه دار شدن قلمه ، سرعت رشد گیاه به حدي نیست که شاخه هاي زیادي تولید نماید تا بتوان از آنها به عنوان منبعی جهت سیکل بعدي تکثیر در کوتاه مدت استفاده نمود و علت گران بودن کاملیا نیز به همین دلیل است. بررسی منابع نشان می دهد که با استفاده از تکنیک هاي کشت درون شیشه می توان از هر سه شاخه در مدت زمان نسبتاً کوتاهی سرشاخه هاي متعددي تولید و تکثیر نمود.

روشهاي ریز ازدیادي
در یک آزمایش ، براي تهیه جداکشت از گیاهانی با عمر بیش از 60 سال استفاده شد. بهترین جداکشت در مرحله استقرار ، قطعات گرهی ( nodal section) و بهترین محیط در این مرحله   WPMتشخیص داده شد. براي شاخه زایی از هورمون BA با غلظت 4 میلی گرم در لیتر استفاده شد که بهترین نتیجه را داشت. ریشه زایی در محیط هاي فاقد هورمون در حالی که غلظت عناصر پرمصرف به نصف کاهش یافته بود، بهترین نتیجه را بهمراه داشت. قراردادن برگهاي کشت شده به طریق کشت درون شیشه در محلول یک میلی گرم در لیتر IBA (به مدت 30 دقیقه) و سپس انتقال به محیط WPM بدون هورمون، تحت تیمار تاریکی به مدت 14 روز ، موجب تولید کالوس در سطح برگها گردید.

ریز ازدیادي بنفشه آفریقایی    Micropropagation of Saintpaulia

تکثیر سنتی این گیاه از طریق قلمه برگ صورت می گیرد لکن تحت شرایط مناسب هورمونی ، باززائی با جداکشتهایی از دمگل، قطعات برگ و یا حتی یافته هاي اپیدرمی انجام می شود.

روش کار تجاري: برگهاي بالغ جداشده و با ماده پاك کننده (شوینده) شسته می شوند. سپس حدود 15 دقیقه در محلول %1-2 هیپوکلریت سدیم قرار می گیرند سپس چهار تا پنج بار با آب سترون آب کشی می شوند . حواشی برگها حذف و باقی مانده آن به مربع هایی با مساحت 10 میلی متر بریده می شوند .  سپس هر  قطعه روي محیط کشت MS کشت می شود. غلظت آگار در این محیط % 0.9 و ساکارز %3 می باشد همچنین به عنوان تنظیم کننده رشد از بنزیل آدنین  ( 0.8 میلی گرم در لیتر ) و IAA  ( 2 میلی گرم در لیتر) استفاده می شود. قابل ذکر است که محیط هاي کشت باید در دماي 27 درجه سانتی گراد و شرایط 1000 لوکس روشنایی و تحت تیمار 16 ساعت روشنایی و 6 ساعت تاریکی قرار گیرند. پس از رشد اندامهاي هوایی و به منظور ریشه زایی موفق باید در واکنشهاي بعدي (تغییر محیط کشت و تهیه محیط کشت جدید براي جداکشت) از محیط هاي بدون هورمون استفاده کرد.

مزایا و معایب ریز ازدیادي

مزایاي ریزازدیادي به شرح زیر است:

•    سرعت تکثیر بسیار بالا. در گونه هایی که به آسانی باززائی می کنند با کشت انتهاي شاخه و واکشت جوانه هاي جدید باززائی شده، تعداد بسیار زیادي گیاهچه در مدت زمان کم ، حاصل می شود.
•    نبود محدودیت فصلی براي تولید گیاه. این مورد به ویژه براي گیاهان گلخانه اي کاربرد دارد.
•    تولید گیاهانی که ازدیاد آنها مشکل است. با این روش می توان ارقام جدید و گونه هاي با این شرایط را به بازار عرضه کرد.
•    ریز ازدیادي گیاهان منحصر به فرد ممتازي که در مزرعه و فقط با بذر تکثیر می شوند. بنابراین با گزینش گیاهان مزرعه اي با فرمها و تولیدات مطلوب ، می توان آنها را با ریز ازدیادي و به فرم رویشی تکثیر کرد تا امکان به دست آوردن بذر کافی از این گیاهان وجود داشته باشد.
•    نگهداري لاینهاي خالص خود ناسازگار براي استفاده در تولید بذر هیبرید. ریز ازدیادي براي نگهداري لاینهاي خالص ، روشی را فراهم می کند که نیاز به گرده افشانی دستی ندارد. گیاهچه ها فقط زمانی اجازه بلوغ پیدا می کنند که مرحله گلدهی آنها براي تولید بذر لازم باشد.
•    تولید پایه هاي عاري از ویروس در گیاهانی نظیر توت فرنگی ، سیب زمینی ، میخک و غیره با کشت مرستیم.
•    رفع موانع مطلق جوانی زنی بذر، در تعدادي از گونه هاي گیاهی جوانه زنی در شرایط طبیعی مطلقاً امکان پذیر نیست. در این موارد استفاده از کشت بافت ضروري است.
•    جلوگیري از سقط جنین در حالت ناسازگاري : در بعضی موارد ناسازگاري بین گونه ها یا ارقام، بعد از تشکیل جنین اتفاق می افتد و منجر به سقط جنین می شود. چنین جنین هایی را در حالت نارسی و قبل از سقط شدن می توان خارج کرده و در شرایط درون شیشه اي آنها را رشد داد .
•    کشت بافت کاربردهاي صنعتی نیز دارد به این معنی که با استفاده از کشت بافت توانایی سنتز و تولید ترکیبات مفید به مقدار قابل توجهی افزایش می یابد. این ترکیبات شامل : داروهاي آلکالوئیدي، ترکیبات ضد میکروبی، ویتامینها، حشره کشها، آنزیمها، مطبوع کننده هاي اغذیه و شیرین کننده ها می باشد.

معایب ریز ازدیادي:

•    گیاهچه هاي تولید شده ظریف، داراي کوتیکول نازك و ریشه هاي موئین کمی هستند که نیاز به جابجایی ماهرانه توسط افراد تعلیم دیده دارند.
•    نیاز به وسایل گران قیمت براي تولید در مقیاس وسیع.
•    نیاز به مراقبت کامل گیاهان مادري براي جلوگیري از آلودگی به حشرات و پاتوژنها.

منابع :

•    کوروش وحدتی (1383) جزوه کشت بافت گیاهی ، دانشکده کشاورزي کرج.
•    مرتضی خشخوي (1382) ازدیاد نباتات، مبانی و روشهاترجمه،جلد – 3    . انتشارات دانشگاه شیراز.
•    مرتضی خشخوي (1373) فنون کشت بافت براي گیاهان باغبانی –ترجمه انتشارات دانشگاه شیراز.
•    باقري هدایت و آزادي پژمان (1381) کشت بافت گیاهی ، تکنیکها و آزمایشها – ترجمه، انتشارات جهاد دانشگاهی دانشگاه مشهد.
•    احمد معینی و دانیال کهریزي (1382) کشت بافت گیاهی – ترجمه، انتشارات سازمان بسیج دانشجویی .
•    عبدالرضا باقري و مهري صفاري (1376) مبانی کشت بافت گیاهی – ترجمه . انتشارات دانشگاه فردوسی مشهد .
•    قدیر نوري قنبلانی (1371) تجربیاتی در زمینه کشت بافتهاي گیاهی  ، ترجمه انتشارات دانشگاه تبریز.
•    تعیین مناسب ترین محیط کشت براي تولید بیشترین شاخساره ریشه داد شده در کشت بافت میخک . پایان نامه کارشناسی ارشد – (1378) موسی ترابی گیلگو و سیروس سیما و اسلام مجیدي . دانشکده کشاورزي دانشگاه تبریز.
•    ازدیاد کاملیا به روش کشت بافت . پایان نامه کارشناسی ارشد (1374) حسن حسن آبادي و اسلام مجیدي . دانشگاه تربیت مدرس.
•    تکثیر ارکیده هاي سیمبیدیوم و کاتلیا، به روش کشت بافت پایان نامه کارشناسی ارشد . (1375) سعداله علیزاده اجیرلو و اسلام مجیدي. دانشگاه تربیت مدرس.