کاربرد مهندسی ژنتیک در ایجاد گیاهان مقاوم به بیماریها

کاربرد مهندسی ژنتیک در ایجاد گیاهان مقاوم به بیماریها

چکیده
دانش مهندسی ﮊنتیک از حدود 160 سال پـیش بـا کشـف قـوانین وراثـت صـفات زیسـتی، آغـاز گردیـده و در آن روشهای جداسازی و خالص سازی DNA از سلول، همانندسازی و تکثیـر قطعـه هـای آن بـا واکـنش زنجیـره ای پلیمـراز، شناسایی و خالص نمودن ﮊنهای مطلوب و انتقال آنها به درون سلول گیاهان به طور غیر مستقیم بـا اسـتفاده از بـاکتری Agrobacterium tumefaciens  و یا به طور مستقیم با تفنگ ﮊنی و تولید گیاه کامل تراریخته از سلول تراریخته با کشت بافت، در طی ۴ دهه اخیر ابداع و کامل گردیده اند. با استفاده از این فنآوری امکان انتقال ﮊنهای مطلوب، بدون همراهـی بـا هیچ ﮊن نامطلوبی به گیاهان میسر شده است و گیاهان تراریخته مقاوم به بیماریهای قارچی، باکتریایی، ویروسی، نماتدها و تنشهای محیطی تولید شده اند. مهندسی ﮊنتیک امیدی برای مدیریت بهتر بیماریهای گیاهان و افزایش تولید محصـولات کشاورزی برای تامین نیازهای غذایی جمعیت روزافزون انسان، به وجود آورده است.

مقدمه
دانش مهندسی ﮊنتیک (Genetic engineering) در واقع با کشف قوانین وراثت صفات در حدود 160 سال پیش و آشکار شدن اینکه هر صفت قابل توارث توسط عاملی به نام ﮊن (Gene) کنترل میشود، آغاز شد. در اوایل قرن بیستم میلادی مشخص شد که ﮊنها روی کروموزومها (Chromosomes) و در هسته سلول قرار دارند. در سال 1952 ثابت شد که اسیدداٌکسی ریبونوکلئیک (Deoxyribonucleic acid = DNA) ماده اصلی ﮊنتیکی جانداران است و هر ﮊن در واقع توالی خاصی از این مولکول است. در طی 14 سال یعنی بین سالهای 1952 تا 1966 ساختار مارپیچ مضاعف این ماده و نحوه همانندسازی (Replication) ، نسخه برداری (Transcription) و ترجمه (Translation) آن شناخته شدند. در خلال دهه 1980 روش برش دادن و تکثیر قطعات مولکول DNA و شناسایی ﮊنهای مطلوب در شرایط آزمایشگاهی ابداع شد. سپس روشهای انتقال ﮊنها و تولید گیاهان تراریخته  (Transgenic)، ابداع شدند. با استفاده از این فنآوری امکان انتقال ﮊنهای مطلوب، بدون همراهی با هیچ ﮊن نامطلوبی، به گیاهان میسر شده است. اکنون سالیانه دهها رقم گیاهان تراریخته که دارای ﮊنهای مطلوب، از جمله مقاومت به بیماریها، هستند، در کشورهای مختلف جهان، در طی مراحل زیر تولید و به کشاورزان عرضه میشوند (براون،  2010)

1.    مراحل تولید گیاهان تراریخته
برای این هدف، ابتدا صفت مورد نظر در جاندار ( ارقام مختلف همان گیاه ، گیاهان دیگر، بـاکتری ، قـارچ و یـا سـایر جانداران) با انجام آزمونهای آزمایشگاهی ، گلخانه ای و یا مزرعه ای شناخته میشود. آنگاه در طی ایـن مراحـل ﮊن مسـئول آن صفت در مولکول DNA جاندار شناسایی و خالصسازی میشود. ابتدا برای جداسازی و خالصسازی مولکول DNA گیاه ، دیواره سلولی آن با استفاده از آنزیمهای مناسب (سـلولاز، پکتینـــاز و..) شکســـته مـــیشـــود، ســـپس بـــه عصـــاره ســـلولی مـــاده ســـتیل تـــری متیـــل آمونیـــوم برومیـــد (Cetyl trimethylammonium bromide=CTAB)، که با اسیدهای نوکلئیک ترکیب غیرمحلولی ایجاد میکند، اضـافه میشود. پس از سانتریفیوﮊ کردن ترکیب اسید نوکلئیک- CTAB رسوب میکند و کربوهیدراتها، پروتئینها و سـایر مـواد ســلولی در مــایع روی بــاقی مــیمانــد. رســوب را در محلــول ۱ مــولار کلریــد ســدیم حــل مــیکننــد تــا کمــپلکس اســید نوکلئیــکCTAB– شکســته شــود. آنگــاه DNA بــا رســوبدهــی بــا اتــانول تغلــیظ شــده و اســید ریبونوکلئیک  (Ribonucleic acid = RNA) حذف میشود ( شکل۱) .

پــس از جــدا و خــالص ســازی DNA جانــدار، بــا حضــور آغازگرهــا (Primers)، آنــزیمهــای لیگــاز (Ligase) و  DNA پلـــــیمـــــراز polymerase)    (DNA و نوکلئوتیـــــدها در طـــــی واکـــــنش زنجیـــــرهای پلـــــیمـــــراز (Polymerase chain reaction= PCR) قطعـات مولکـول DNA، در شـرایط آزمایشـگاهی، همانندسـازی مـیگردنـد. محصول این واکنش زنجیره ای، که در دستگاه ترموسیکلر (Thermocycler) انجام مـیشـود، چنـد میکروگـرم (ده به توان منفی 6 گـرم) قطعه های کوتاه DNA، از چند نانوگرم (ده به توان منفی نه گرم) DNA اولیه است. پس از این که قطعه هایDNA جانداران اعم از گیـاه حساس و مقاوم نسبت به یک بیماری، قارچ، باکتری و یا جانور دارای ﮊن مطلوب و جاندار فاقد آن ﮊن، به کمک این واکـنش زنجیره ای تکثیر گردیدند، با الکتروفورز محصول این واکنش و مقایسه ﮊنهای این جانداران، ﮊن مطلـوب شناسـایی و سـپس جداســـازی و خـــالصســـازی مـــی شـــود. ﮊن مطلـــوب یـــا بـــه طـــور غیرمســـتقیم بـــا اســـتفاده از بـــاکتری Agrobacterium tumefaciens   و یـا بـه طـور مسـتقیم بـه روش بیولیستیک (Biolistic) یا زیست پرتابی با تفنگ ﮊنی به گیاه منتقل میشود. پـس از انتقـال ﮊن و اطمینـان از تراریختـه شدن سلول گیاه، آن را با قرار دادن روی محیطهای کشت بافـت کـه دارای نسـبتهـای متفـاوتی از هورمـونهـای گیـاهی هستند، به یک گیاه کامل تراریخته تبدیل مینمایند (براون، 2010) .

2.    گیاهان تراریخته مقاوم به بیماریهای قارچی
انتقال ﮊن کیتیناز بـاکتری Serratia marcescense Bizio 1823  ، بـه توتـون، لوبیـا و کـانولا باعـث مقاومـت آنها به مرگ گیاهچه ناشی از قارچ Rhizoctonia solani Kohn گردیده است .(Brogli et al. 1991)
انتقال ﮊن کیتیناز به واریته Costle  Rock گوجه فرنگی باعث افزایش مقاومـت آن بـه پژمردگـی آونـدی ناشـی از   Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici W. C. Snyder & H. N. Hansen گردیـد، بـه طـوری کـه بوتـه هـای تراریخته تا 60 درصد متحملتر از بوته های غیرتراریخته شاهد بوده و نشانه های بیماری بـا تـاّخیر در آنهـا ظـاهر گردیـد . .(Dina et al., 2008)
کانولای تراریخته حاوی ﮊن های آنزیمهای کاتالاز، پراکسیداز و پلیفنـل پراکسـیداز باکتریـایی در کلروپلاسـت، بـا استفاده از روش انتقال ﮊن توسط آگروباکتریوم تهیه شدند. مقاومت و سـطح تحمـل ایـن گیاهـان نسـبت بـه دو بیمـارگر انـــدامهـــای هـــوایی بـــه نـــامهـــای Peronospora    parasitica  (Pers.)  Fr.  (عامـــل ســـفیدک کرکـــی) و Erysiphe polygoni DC. (عامل سفیدک پودری) ، در گلخانه و تحت شرایط حمله هر دو بیمـارگر مـورد بررسـی قـرار گرفت. زیست سنجی بوته ها نشان داد که رشد و پیشرفت هر دو بیمارگر در برگهای بوته های تراریخته نسبت به شاهد بـه طور معنیداری کمتر است و این رقم مقاومت بالایی نسبت به بیماریهای سفیدکهای کرکی و پودری یافته اسـت. آنـالیز شیمیایی این گیاهان نشان داد آنزیمهای پراکسیداز و پلیفنل پراکسیداز به طور چشمگیری در برگهای آنهـا نسـبت بـه شاهد بیشتر است .(EL-Awady et al., 2007) ﮊنهــای بیــان کننــده ۲ آنــزیم تخریــب کننــده دیــواره ســلولی بــه نــامهــای انــدوکیتیناز و اگزوکیتینــاز در قــارچ Trichoderma atroviride P. Karst. شناسایی شده و به صورت تک یا جفت به برنج منتقل گردیده اند. نتـایج نشـان دادند که ﮊن اندوکیتیناز باعث افزایش مقاومت گیاه بـرنج بـه بیمـاری سـوختگی غـلاف بـرگ مـیشـود، در حـالی کـه ﮊن اگزوکیتیناز در این مورد تأثیر کمتری دارد. با این وجود اگزوکیتیناز نسبت به انـدوکتیناز، زمـانی کـه ۲ ﮊن بـا هـم منتقـل شدند، تأثیر بهتری داشت. این ﮊنها در ایجاد مقاومت به بیماری بلاست نیز موثر بودند .(Mei et al., 2004)
ارقــام  رز تراریختــه شــده بــا ﮊن کیتینــاز 13 تــا 43 ٪ کمتــر نشــانه هــای بیمــاری لکــه ســیاه ناشــی از قــارچ Diplocarpon rosae F.A. Wolf نشان داده اند . (Marchant et al., 1998)
برگهای لاینهای کلم بروکلی تراریخته که ﮊن انـدوکیتیناز قـارچ Trichoderma harzianum Rifai را دریافـت نموده اند، با هاگهای قارچ بیمارگر Alternaria brassicicola (Schwein.) Wiltshire تلقیح شدند، آنها نشـانه هـای بیماری را به طور معنیداری کمتر از شاهد نشان دادند و اندازه لکه های حاصل از بیمارگر با میزان فعالیت آنزیم انـدوکیتیناز در آنها همبستگی منفی داشت .(Mora & Earle, 2001)
انتقال ﮊن یک آنزیم انسانی به ۲ رقم هویج Kurodagosun(K5) و Nahtes Scarlet (NS) ، باعث مقاومت آنهـا به قارچهای بیمارگر Erysiphe heraclei DC. (عامل سـفیدک پـودری) و Alternaria dauci (J.G. Kühn) J.W. Groves & Skolko (عامل سوختگی)، گردیده است  .(Takaichi & Oeda, 2000)
انتقــال ﮊن مقاومــت 206 DRR از نخــودفرنگی بــه کــانولا باعــث مقاومــت آن بــه بیمــاری ســاق ســیاه ناشــی از Leptosphaeria maculans (Fuckel) Ces. & De Not.  شده است . ( Wang et al., 1999)

3.    گیاهان تراریخته مقاوم به بیماریهای باکتریایی
بیماری پژمردگی موز کـه بـه وسـیله بـاکتری Xanthomonas  campestris  pv.  musacearum  ایجاد میشود یک بیماری رایج در بسیاری از مناطق آفریقا است، که از ایران نیز گـزارش شده است (امانی و همکاران، 1390 )، باانتقال ﮊن Harp فلفل شیرین به لاینهای Sukali Ndiiei و Mpologoma موز با استفاده از ناقل آگروباکتریوم آنها به این بیماری مقاوم گردیدند . (Tripathi et al., 2010)
تراریخت کردن یک رقم برنج با ﮊن ap1 از فلفل شیرین که یک نوع پروتیین تولید مینماید باعـث مقاومـت آن بـه بیماری سوختگی باکتریایی ناشی از نژاد
  ۶ Xanthomonas oryzae pv. Oryzae (Ishiyama 1922) Swings, Van

den Mooter, Vauterin, Hoste, Gillis, Mew & Kersters 1990 شده است . (Tang et al. , 2001)
 

4.    گیاهان تراریخته مقاوم به بیماریهای ویروسی
ویروسها از بیمارگرهای مهم گیاهان هستند که باعث خسارت اقتصادی به محصول میگردند. در اوایل قرن بیسـتم میلادی تنها روشهای قرنطینه، ریشه کنی و از بین بردن گیاهان بیمار، برقـراری تنـاوب زراعـی، اسـتفاده از بافـت گیـاهی تکثیری سالم و شناسایی و یا تولید ارقام مقاوم از طریق اصلاح گیاهان برای مبارزه با این بیمارگرها شناخته شده بـود، ولـی در سال 1922 حفاظت توتون از آلودگی به ویروس موزاییک توتون (Tobacco mosaic virus=TMV) با مایه زنی آن بـا سویه خفیف همین ویروس گزارش شد. روشی که سپس به حفاظت تقاطعی (Cross protection) مشهور گردیـد و بـرای مبارزه با بیماریهای ویروسی گوجه فرنگی، پاپایا و مرکبات نیز مورد استفاده قرار گرفت، ولی این روش پرهزینه بود و امکان این وجود داشت که ویروس خفیف مایه زنی شده به یک رقم گیاه برای رقم دیگر همان گیاه و یا برای سـایر گیاهـان تحـت کشت در آن منطقه بیماریزا و خطرناک باشد. در سال 1985 با ابداع و تکمیل روشهای انتقال ﮊن، ایده انتقال قسمتی از ﮊنوم ویروس به گیاه ، به جای مایه زنی آن، مطرح شد و در سال 1986 توتون تراریخته با ﮊن کدکننـده پوشـش پروتیینـی ویروس موزاییک توتون، که مقاومت بالایی در برابر آلودگی به بیماری نشان میداد وارد بازار شد. سپس کـدوهای تراریخـت شـده بـا ﮊن پـروتیین پوششـی ویـروسهـای
موزائیـک خیـار  (Cucumber mosaic virus= CMV)،
موزائیـک کـدو  (Squash mosaic virus=SqMV)
و موزائیک هندوانه  (Watermelon mosaic virus=WMV)
 و پاپایاهای تراریخت شده با ﮊن پروتیین پوششی ویروس لکه حلقوی پاپایا (Papaya ringspot virus= PRSV) ، سویای تراریخت شده با ﮊن پروتیین پوششی ویروس موزائیک سویا (Soybean mosaic virus=SMV)، توتون تراریخت شده با ﮊن پروتیین پوششی ویروس پیسک رگبرگ توتون (Tobacco vein mottling virus=TVMV)، طالبی تراریخت شده بـا ﮊنهـای پـروتیین پوششی ویروسهای موزاییـک خیـار ، موزائیـک زرد کـدو (Zucchini yellow mosaic virus= ZYMV) و موزائیـک هندوانـــه ، ســـیب زمینـــی تراریخـــت شـــده بـــا ﮊن پـــروتیین پوششـــی ویـــروس پیچیـــدگی بـــرگ ســـیب زمینـــی  (Potato leafroll virus= PLRV)، گوجه فرنگی تراریخت شده بـا ﮊن پـروت یین پوششـی ویـروس موزائیـک خیـار، کـدو تراریخت شده با ﮊن پروتیین پوششی ویـروس موزائیـک کـدو، مرکبـات تراریخـت شـده بـا ﮊن پـروتیین پوششـی ویـروس تریستیزای مرکبات (Citrus tristeza virus=CTV) ، فلفل قرمز تراریخت شده با ﮊنهای پروتیین پوششـی ویـروسهـای موزائیــک خیــار و موزائیــک توتــون و کــانولای تراریخــت شــده بــا ﮊن پــروتیین پوششــی ویــروس موزائیــک شــلغم   (Turnip mosaic virus=TuMV)، که مقاومت معنیداری نسبت به بیمـاری ویـروس مربوطـه نشـان مـی دهنـد، تولیـد شده اند .(Scholthof et al., 1993)

5.    گیاهان تراریخته مقاوم به نماتدها
توتـــون تراریختـــه بـــا ﮊن ATNPR1 مقاومـــت معنـــی داری نســـبت بـــه نماتـــد مولـــد غـــده ریشـــه Meloidogyne incognita (Kofoid & White) Chitwood نشـان داده، بـه طـوریکـه در گیـاه تراریختـه وزن قسمتهای هوایی و ریشه به میزان معنیداری بیشتر از گیاه غیرتراریخته و تعداد غـده و تـوده تخـم نماتـد روی ریشـه آن بسیار کمتر از گیاه غیر تراریخته بود . (Priya et al ., 2011)
دو رقم یونجه تراریخته شده با ﮊنهای کدکننده oryzacystatin I و oryzacystatin II به دست آمده از بـرنج بـا نماتد مولد زخم ریشه  Pratylenchus penetrans (Cobb) Filipjev & Schuurmans Stekhoven  مایه زنـی شـدند ، هر ۲ رقم مقاومت معنیداری نسبت به بیماری نشان دادند، به طوری که جمعیت نماتـد در اطـراف ریشـه ایـن ۲ رقـم بـه ترتیب 29 و 32 % کمتر از شاهد بود (Samac & Smigocki, 2003)

6.    گیاهان تراریخته مقاوم به تنشهای محیطی
تنشهای محیطی نظیر خشکی، گرما یا سرمازدگی و شوری آب و خاک میتوانند باعث خسارت اقتصادی به گیاهان و کاهش معنیدار، تا 70%، محصولات زراعی، باغی، سبزی و صیفی گردند. با شناسایی ﮊنهای مقاومت بـه ایـن تـنشهـا و انتقال آنها به گیاهان موفقیتهای چشمگیری در این زمینه در طی ۳ دهه اخیر به دست آمده اسـت. بـه عنـوان مثـال بـا تولید برنج تراریخته با ﮊن کدکننده پروتیین گلوتامین اس ترانسفراز ( Glutamine s -transferase ) تحمل این گیـاه نسـبت به سرما افزایش یافته و سرعت جوانه زنی بذر آن در حالت غرقابی افزایش یافته و امکان تولید بیش از یک نوبـت آن در طـی سال با کشت مستقیم بذر در زمین اصلی فراهم گردیده است .(Bajaj & Mohanty, 2005) تراریخته نمودن چند لاین توتون با ﮊن کدکننده تری هالوز فسفات سینتاز (Trehalose phosphate synthase) از بـــاکتری  Escherichia coli (Migula 1895) Castellani & Chalmers 1919 ، بـــه کمـــک ناقـــل A. tumefaciens ، باعث افزایش مقاومت آنها به خشکی گردیده است، به طوری که وقتی آنها تحت تنش خشکی قـرار گرفتند، در حالی که لاین غیر تراریخته کاملاٌ پژمرده گردید، لاینهای تراریخته بین 25 تا 60% تحمل نسبت به این تـنش نشان دادند .(Lee et al., 2012)
 
7.    نتیجه
جمعیت جهان در سال 80 میلیون نفر افزایش می یابد و سازمان خواربار جهانی پیشبینی کرده بـرای از بـین بـردن گرسنگی در جهان لازم است میزان تولید محصولات کشاورزی در طی ۲ دهه آینـده 60 % افـزایش یابـد. تولیـد و کاشـت گیاهان تراریخته یکی از روشهای نوین و امیدبخش برای مدیریت بهینه بیماریهای قارچی ، ویروسی، باکتریـایی، نماتـدی، تنشهای محیطی، آفات و علفهای هرز است، تا تولید محصولات کشاورزی برای تامین نیازهای غذایی جمعیـت روزافـزون انسان ، افزایش یابد و کشاورزی پایدار برقرار گردد .(Park et al., 2011)

منابعگیاهان مقاوم به بیماریها
امانی، م.، حسنزاده، ن. و رضائی، س. 1390 . بیماری لکه برگی و نکروز باکتریایی مـوز. دانـش بیمـاریشناسـی گیـاهی ۱(۱): ۳۳-27.
براون، ت. آ. 2010 . کلونسازی ﮊنها و آنالیز . DNA ویـرایش ششـم. م. طباطبـایی یـزدی، غ. زرینـی، ض. سـپهریزاده، ع. قاسمیان و آ. همت (مترجمین). خانه زیستشناسی، 1390 ، 439 ص.
سالاری، م. و امام جمعه، ع. 1385 . فنآوری انتقال ﮊن در گیاهپزشکی. نشر بنفشه، 130 ص.

دریافت فایل pdf مقاله از اینجا

تهیه کننده :
مهدی صدروی

دانشیار بیماریشناسی گیاهی، گروه گیاهپزشکی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه یاسوج

همچنین میتوانید با مراجعه به پستهای زیر مطالبه مفیدی را مشاهده نمایید

میکرو ارگانیسم های بیمارگر حشرات

بررسی جنبه های مختلف گیاهان تراریخته