روشهای جداسازی نماتدها
جداسازی نماتدها:
اغلب نماتدهای انگل گیاهی تمام یا حداقل بخشی از چرخه زندگی خود را در خاک سپری می کنند. جهت جداسازی نماتدها در ابتدا نمونه گیری از خاک انجام می گیرد. نمونه برداری غالباً از منطقه ریزوسفر یا فرا ریشه(rizosphere) انجام می گیرد. جمعیت نمتدها در خاک های سبک و نیمه مرطوب اطراف ریشه در عمق 5-30 cm نسبتاً قابل توجه می باشد. پرکندگی نماتدها در مزارع غالباً به صورت موضعی(local) است . می توان از یک مزرعه به زیگزاک به فواصل 3-5 متر نمونه های کوچکی (subsaple)، در حد 500-200 گرم،برداشت کرد و در صورت کوچک بودن مزرعه(کمتر از یک هکتار) این نمونه های کوچک را با هم مخلوط کرده و بعد از آن مقداری خاک در حد 500-200 گرم انتخاب می کنیم.
جهت جداسازی نماتدها از خاک و دیگر محیط ها(بدن حشرات و بافت های گیاهان) از سه روش ذیل می توان استفاده کرد:
1-سانتریفوز یا شناورسازی در آب Centrifuge or sugar flotation method
2-قیف بیرمن Baermann funnel method
3- غربال Sieving method
روش سانتریفوژ یا شناور سازی در آب:
در این روش با استفاده از چند سری الک و دستگاه سانتریفوز نماتدها را جدا می کنند. این روش توسط De Grisse ابداع شده است. در این روش به ترتیب ذیل عمل می شود:
1- ابتدا خاک را به صورت دوغاب در آورده و از الک درشت به قطر منافذ 2-3 میلیمتر عبور می دهیم .
2- سوسپانسیون خاک را به ترتیب از الک های 45 مش(355 میکرومتر)، 60 مش (250µm )، 100 مش (150 µm) و 400 مش (37 µm) عبور می دهند.
3- سوسپانسیون بر جای مانده در الک 400 مش را در استوانه مدرج به حجم 1000 یا 500 سی سی ریخته و به مدت 20-30 دقیقه صبر می کنیم تا ذرات سبک (خار و خاشاک و هوموس) خاک در سطح سوسپانسیون جمع شوند.
4- پس از این مدت، ذرات سبک جمع شده بر سطح آب را از سوسپانسیون جدا می کنیم. برای اینکار می توان مقدار کمی آب به استوانه مدرج اضافه کرد تا ذرات سبک سطح سوسپانسیون به آرامی شسته شوند.
5- به میزان 500-300 سی سی از قسمت ته نشین شده در استوانه مدرج را برداشته وپس از همگن کردن به طور مساوی در تیوپ های سانتریفوژ می ریزیم. می توان پس از جدا کردن ذرات سبک از سطح سوسپانسیون، مجدداً محتویات استوانه مدرج را در الک 400 مش ریخته و محتویات الک 400 مش را در یک بشر جمع آوری می کنیم . با این کار حجم سوسپانسیون کاهش یافته و سپس به تیوب های سانتریفوژ منتقل می کنیم. تیوب های سانتریفوژ باید دو به دو ، وزن یکسانی از سوسپانسیون را دریافت کنند. (مش: Mesh : به تعداد منافذ موجود در یک اینچ طول (2.54 cm) اطلاق می گردد.)
6- سانتریفوژ را به مدت 5 دقیقه به 5000 دور در دقیقه جهت آبگیری از نمونه ها انجام می دهیم می تئان میزان دور را کم و در مقابل زمان سانتریفوژ را بیشتر کرد.
7- پس از پایان سانتریفوژ آب روی لول ها را دور ریخته(بهتر است روی الک 400 مش خالی کنیم) و به جای آب به لوله ها محلول آب شکر به جرم حجمی 1.18 gr/cm3 اضافه می کنیم.
8- برای تهیه محلول آب شکر به جرم حجمی 1.18 gr/cm3 ، در یک استوانه مدرج به حجم 1000 سی سی، 700 cc آب ریخته و آنقدر شکر اضافه می کنیم تا حجم محلول به 1000 برسد. نسبت آب و شکر باید 700 به 300 باشد. (در سانتریفوژ ، تیوب ها را حداکثر تا 3/2 حجم آن ها از سوسپانسیون خاک یا آب شکر پر میکنیم)
9- پس از اضافه کردن آب شکر و تنظیم وزن تیوب های مقابل هم ، محتویات تیوپ را همگن کرده و در دستگاه سانتریفوژ قرار می دهیم.
10- عمل سانتریفوژ را به مدت یک دقیقه با سرعت هزار دور در دقیقه انجام می دهیم
11- بلافاصله پس از اتمام سانتریفوژ، تیوب ها را از دستگاه خارج و محتویات رویی آن ها را در الک 400 مش خالی می کنیم. همزمان جهت شسته شدن شکر، شیز آب را روی الک باز می کنیم
12- نهایتاً محتویات الک 400 مش را در یک پتری ریخته و زیر بینوکولر مشاهده می کنیم . برای جا کردن نماتدهای که درون ریشه هستند(مانند جنس های Pratylenchus و Radopholus) به تیوپ های سانتریفوژ مقداری خاک کائولن(خاک چینی) اضافه کرده تا ریشه های خرد شده در ته تیوپ ها باقی بماند و نماتدها را از آنجا حرکت ندهند.
روش قیف بیرمن:
برای جداسازی نماتدهای موجود در خاک، بدن حشرات و گیاه میزبان می توان استفاده کرد
مرااحل آن به شر ذیل است:
1-انتهای یک قیف شیشه ای را به یک لوله ی پلاستیکی به طول 10-20 سانتی متر وصل می کنیم و انتهای لوله را با یک گیره مسدود می کنیم
2-در محل قیف یک توری فلزی یا پلاستیکی(درحدود 10 مش یا کمتر) قرار می دهیمقیف را تا زیر توری از آب پر می کنیم.
3- یک لایه نازک از دستمال کاغذی یا پارچه با منافذ نسبتاً ریز روی توری قرار می دهیم.
4-روی پارچه یا دستمال کاغذی مقداری خاک یا خرد شده ی گیاهان یا حشرات را می ریزیم .
5-نماتد های موجود در خاک یا نمونه به درون آب شنا کرده و با گذر از پاچه یا دستمال کاغذی وارد لوله می . پس از 14 ساعت می توان نماتدها را استخراج کرد.
6-قرار دادن یک لامپ روشن روی قیف سبب حرکت سریعتر نماتدها به طرف پایین قیف می گردد
7-می توان به جا قیف از صفحات بزرگتر توری که دارای یک صفحه سینی مانند در زیر خود هستند استفاده کرد.
8- در این روش غالباً نماتدهای آزادو بسیار فعال و زنده از منافذ دستمال کاغذی یا پارچه عبور کرده و به دست می آیند. و در مقابل نماتدهای مرده و کم تحرک مانند اغلب نماتدهای گیاهی از منافذ عبور نمی کنند.
روش غربال
این روش در واقع تلفیقی از دو روش قبلی است. به این ترتیب که پس از تهیه سوسپانسیون خاک، آن را از الک های 400،100،100،45 مش عبور داده و سپس محتویات الک 400 را در یک بشر میریزیم.دهانه ی بشر را به کمک یک پارچه یا توری بسیار نازک به کمک یک نوار لاستیکی کاملاً مسدود می کنیم سپس بشر را وارونه روی قیف بیرمن قرار میدهیم
تهیه اسلایدهای دائمی از نماتدها
برای تهیه اسلایدهای دائمی از نماتدهی استخراج شده، نماتدها را درون محلول گلیسیرین فیکس میکنیم. برای فیکس کردن نماتدها آب موجود در پتری محتوی نماتدها را تا حد امکان به کمک باریکه دستمال کاغذی یا پنبه خارج کرده و محلول های فیکسا تیو را به ترتیب ذیل به پتری محتوی نماتدها اضافه می کنیم:
1- فیکساتیوІ(شامل 10% فرمالین 40% ، ا%اسید استیک، ا%گلیسیرین و 88% آب مقطر)
2- فیکساتیوп(شامل 5%کلیسیرین و 95%الکل اتانول)
3- فیکساتیوш(شامل 50% گلیسیرین و 50% الکل اتانول)
به میزان 2-3 سی سی از فیکساتیوІ را در لوله ی آزمایش تا حدود 80 درجه سانتیگراد (نزدیک به جوشیدن) حرارت داده و روی پتری محتوی نماتدها خالی میکنیم. پتری را درون دیسکاتور حاوی کمی الکل اتانول ، در انکوباتور به دمای 40-35 درجه به مدت 24 ساعت قرار می دهیم،پس از این مدت فیکساتیوІ را همانند آب اضافی پتری خالی کرده و فیکساتیوп را به میزان 2-3 سی سی بدون گرم کردن به پتری اضافه می کنیم و در انکوباتور به مدت 4 ساعت با همان دما قرار می دهیم.سپس فیکساتیوп را خارج کرده و فیکساتیوш را به میزان 2-3 سی سی بدون گرم کردن به پتری اضافه و در دیسکاتور حاوی cacl2 قرهر می دهیم تا به تدریج الکل از محیط پتری خارج و گیلیسیرین تمام بدن نماتد را فرا بگیرد.برای تهیه اسلاید دائمی، ابتدا روی یک لام تمیز به کمک لوله ی شیشه ای یا چوب پنبه سوراخ کن، یک حلقه پارافینی به قطر تقریباً1-1.5 سانتیمتر ایجاد می کنیم سپس یک قطره ی کوچک از گلیسیرین در مرکز حلقه پارافین قرار داده و 2-3 نماتد هم شکل و هم اندازه را روی آن قرار می دهیم.لامل را به آرامی روی حلقه ی پاافین قرار داده و حرارت می دهیم تا حلقه ی پارافین ذوب شود. کمی صبر می کنیم تا پارافین مجدداً منجمد شود. می توان به جای حلقه ی پاریفین از رشته هی نازک پشم شیشه یا الیاف پلاستیکی استفاده کرد
