گال طوقه

نام دیگر بیماری: سرطان طوقه

بیماری گال طوقه به عنوان خسارتزاترین بیماری باکتریایی قرن بیستم شناخته شده است. عامل آن باکتری Agrobacterium tumefaciens است که در میـان بـاکتری هـا، بیـشترین تعـداد میزبانان گیاهی را به خود اختصاص داده و به ۶۳۴ گونه از ۳۳۱ جنس و ۹۳ خانواده گیاهی، اعـم از چوبی(مثمر یا غیر مثمر) تا زراعی مانند چغندرقند حمله میکند. میزبان اصلی این بـاکتری گیاهـان دولپه ای اند و فقط %۳ گیاهان تک لپه به آن حساس هستند. این باکتری در حداقل ۴۰ گونه گیاهی از گیاهــان رز، تبریــزی، میخــک، درختــان میــوه هــسته دار، دانــه دار، دانــه ریــز (انگــور و انجیــر) و خشکباری اهمیت اقتصادی دارد. در درختان میوه خشکباری در گردو، بادام و پکان شـایع تـر، در فندق کمیاب و از پسته گزارش نشده است. این باکتری در میخک، مو، انجیر و  رز سیستمیک مـی شود. بیماری گال طوقه در باغ و به خصوص در خزانه اهمیت اقتصادی بالایی دارد.

بــاکتری A. tumefaciens متعلــق بــه سلــسله پروتوباکتریــا، خــانواده ریزوبیاســه، رده آلفاپروتوباکتریا و راسته ریزوبال است. در طی ۱۰۰ سال گذشته، طبقه بندی جنس اگروبـاکتریم دستخوش تغییرات زیادی شده است. این جنس در ابتدا بر اساس خصوصیات بیماریزایی بـه چهـار گونــه شــامل A. tumefaciens (گــالزا در بــسیاری گیاهــان)، A. rubi (گــالزا در تمــشک)، A. rhizogenes (ریــشه زا)، A. radiobacter (غیــر بیمــاریزا )  تقــسیم شــده بــود کــه بعــداً A. larrymoorei (عامل گال هوایی در انجیر برگ ریز   )  نیز به آن اضافه شد. سپس بـر اسـاس خواص بیوشیمیایی و فیزیولوژیک، بعـضی گونـه هـا بـه چنـد بیـوار تقـسیم شـدند . کـه بیوارهای ۱ و ۲عمومـاً طیـف میزبانـان وسـیعی داشـته و بیـوار ۳ فقـط در مـو، تمـشک و میخـک بیماریزا است. در گونه A. tumefaciens بیوارهای ۱ و ۲ در گردو گـالزایی دارنـد و بیـوار ۱ نسبت به ۲ خسارت بیشتری به پایه پارادوکس در باغات گردوی کالیفرنیا می زند.

در سال ۲۰۰۱، Young و همکاران، گونه هـای بیمـاریزای جـنس اگروبـاکتریم را بـه جـنس ریزویبوم (باکتریهای تثبیت کننده نیتروژن همزیست ریشه بقولات) انتقـال دادنـد. امـا بـر اسـاس نظرات Farrand و همکاران در سال ۲۰۰۳، دلایل جابجـایی بیـوار ۱ گونـه A. tumefaciens ناکافی بوده و این بیوار تحت نام A. tumefaciens ابقا گردیـد. در حـال حاضـر، بـا توجـه بـه اختلاف نظرهای موجود، این گونه دارای سیستم نامگذاری دو اسمی است .

باکتری A. tumefaciens میله ای شکل با ابعاد ۰٫۶-۱×۱٫۵-۳ میکرون، به صورت تکی یا جفتی، متحرک با ۱-۶ تاژک محیطی، گرم منفی، هـوازی، فاقـد اسـپور، تولیـد کننـده اکـسیداز و کاتالاز و فاقد رنگدانه است. دمای بهینه و حـداکثر دمـای رشـد بـه ترتیـب آن ۲۲ º C و ۳۵ º C است. این باکتری در اغلب گال ها وجود ندارد ولی می توان آن را از گال تازه جداسازی کرد.

بیمــاری گــال طوقــه انتــشار جهــانی دارد. ایــن بیمــاری از دهــه ۱۸۸۰ در ایــالات متحــده و اروپــا شــناخته شــده بــود ولــی مطالعــات دقیــق بــر روی آن از دهــه ۱۸۹۰ شــروع و عامــل بیمــاری برای اولین بـار در سـال ۱۹۰۷ در ایـالات متحـده جداسـازی و شناسـایی شـد. خـسارت اقتـصادی این بیماریبه چند میلیون دلار در سال میرسـد و فقـط در سـال ۱۹۷۶، ۲۳ میلیـون دلار بـه گیاهـان کالیفرنیا خسارت وارد آورد و به عنوان خسارتزاترین بیماری باکتریایی ایالات متحده در سال هـای ۱۹۷۵-۷۷ شناخته شـد. در سـال ۲۰۰۰، %۳۰ درختـان گـردوی کالیفرنیـا آلـوده بـه گـال بودنـد و محصول %۹۵ باغات گردوی کالیفرنیا افت شدیدی داشت. این آلودگی در خزانـه هـای گـردوی کالیفرنیا نیز شایع است و چون درختان گالدار غیر قابل فروش هستند، خـسارت اقتـصادی بیمـاری در خزانه بسیار بالا است.

در ایران، قدیمیترین نمونه گال طوقه مربوط به سال ۱۳۳۷ از درختـان آلـوده مـو در ارومیـه و سپس سال ۱۳۴۳ در تاکستان هـای قـزوین اسـت و تـاکنون در مـو، چغندرقنـد و نهـال هـای میـوه گزارش شده ولی بیشترین خسارت اقتصادی آن روی مو است. در گردو وجود گال در نهالـستانی در گرگان با عامل Rhizobium radiobacter در سال ۱۳۸۹ (روح رضی و رحیمیان) گزارش شده است.

نشانه های بیماری
واضح ترین نشانه این بیماری در گردو تشکیل گال در بالای ریشه در مجاور سـطح خـاک یـا در اندامهای هوایی درخت است.

گال ها ابتدا به صـورت برجـستگیهـای کوچـک در پوست، به خصوص در محل بریدن پاجوش ها، پدیدار میشوند ولی به تدریج دور طوقـه یـا شـاخه پیشروی میکنند و در نهایت کمربندی می شوند. فشار گال ها بر بافتهای مجاور موجب در هـم شکستن آوندهای چوبی و قطع جریان آوندی میشود و در نتیجه، درخت کـم رشـد و کوتـاه قـد میشود. این بیماری بسته به تعداد، اندازه و محل گال و سن درخت در هنگام آلوده شدن، موجـب ضعف، افت محصول، کوتاهی عمر و حتی مرگ درخت می شود.

از نظر ساختاری، گال ترکیبی از بافت پارانیشم تمایز نیافته و بافـت هـای آونـدی بـوده و فاقـد حلقه های پوست و چوب است. گال های تازه، کوچک، نرم و اسفنجی اند اما بـه تـدریج بـزرگ (تا قطر ۳۰ سانتی متر)، خشن، تیره، شکننده و شکافدار میشوند و بـه مـرور زمـان، بخـش مرکـزی آنها میمیرد و حفره ای بر جا میماند که بـه محـل زیـست حـشرات و قـارچهـای پوسـاننده چـوب تبدیل میشود. چنین درختانی در خاک های سبک در اثر بادهای شدید می شکنند.

روش متداول شناسایی این باکتری استفاده از آزمون های بیوشیمیایی/ فیزیولوژیـک و آزمـون بیماریزایی است. شناسایی دقیق تر توسط پی سی آر و آغازگرهای مبتنـی بـر تـوالی نوکلئوتیـدی نواحی خاصی از کروموزم، Ti-plasmid، vir و T-DNA صورت می گیرد. حساسیت آزمون پی سی آر در ترکیب با سرولوژی بیشتر می شـود و اسـتفاده از چنـدین گـروه آغـازگر  ، احتمـال پاسخ های مثبت کاذب را می کاهد.

چرخه بیماری
باکتری A. tumefaciens به مدت طولانی در گال سالم و به مدت ۱-۲ سال در خاک زنـده می ماند. همچنین به شکل ساپروفیت در بافت آوندی درختان آلـوده زمـستان گـذرانی مـی کنـد. تنها راه نفوذ، زخم های تازه در ریشه و طوقه است که در اثر هرس ریشه، پیوند، حذف علفهـای هرز اطراف طوقه، سرمازدگی، تغذیه نماتدها و حشرات از ریشه و بـارش بـرف یـا تگـرگ ایجـاد می شوند. نهالها در خزانه بیش از درختان در باغ در معرض ابتلا هستند زیـرا بـا تربیـت شـدید در خزانه دچار جراحات فیزیکی متعددی می شوند. زخم های ایجاد شده در بذر گردو نیز می توانند راه ورود باکتری باشند. ممکن است در هنگام جوانه زدن بذر، پوست چوبی آن مغز را زخمی کنـد یـا ممکن است بذوری که در انبار جوانه زده اند، موقع کاشت زخمی شوند. باکتری عامل گال توسط مواد آلوده گیاهی، آب آبیاری و باران، حشرات خاکزی، جانوران، انـسان و عملیـات زراعـی منتـشر مـی شود.

باکتری عامل تحت تاثیر جاذبه شیمیایی مواد فنلی (همچون استوسیرینگن ) که از بافت زخمی ریشه میزبان آزاد میشوند، به سوی آن شنا میکند. سپس با تولید رشته های سلولزی به سلولهـای گیاهی و به یکدیگر متصل میشوند و با تولید پروتئین ریکادسین  این پـل اتـصالی را تثبیـت مـی کنند. سپس به کمک پروتئینهای ویرولنس ، T-DNA  خود را به درون سـلول گیـاه منتقـل میکند که پس از ادغام آن در ژنوم گیاه، فرایند تشکیل گال آغاز میشود. تـشکیل گـال طـی ۲۰  ساعت القا می شود و پس از آن دیگر به وجود باکتری برای گالزایی یا ابقـای گـال نیـازی نیـست (شکل ۲ ) .

T-DNA و ژن های ویرولنس بر روی پلاسمید ۱۸۰ کیلو بازی به نـام Ti قـرار دارنـد. ژن هـای ویرولنس واسطه انتقال T-DNA به درون سلول گیاهی اند بدین ترتیب کـه کمـپلکس پروتئینـی  VirD1/D2 ، پلاسمید Ti را برش می دهد و در نتیجـه پلاسـمید خطـی مـیشـود و مـیتوانـد از مجرای پیلوس ( سیستم ترشحی نوع چهار ) وارد سلول گیاهی شود. پس از ورود، کمـپلکس T-DNA و VirD2 توسط پروتئین های VirE2 پوشیده می شود و کل مجموعه، توسـط سـیگنال هسته یاب (تـوالی آمینـو اسـیدی خاصـی در پـروتئین هـای VirE2 و  VirD2 ) بـه سـوی هـسته هدایت می شود. در درون هسته، T-DNA بطور تصادفی در کروماتین گیـاهی ادغـام و فعالانـه توسط دستگاه نسخه برداری گیاه نسخه برداری می شود.

بیان ژن های T-DNA در ژنوم میزبان موجب سنتز آنزیمهایی میشود که گیاه را به سـوی تولیـد موادی بنام اپین  سوق میدهند. اپینها مشتقات اسیدهای آمینه و قندها بوده و منبع اصـلی کـربن و نیتروژن باکتریهای گالزای جـنس اگروبـاکتریم هـستند. تـاکنون ۱۱ نـوع اپـین مختلـف از جملـه اکتوپین، نوپالین، ساکسیناموپین، اگروپین، اگروپین/ مانوپین، مانوپین شناسـایی شـده انـد. بعـضی پلاسمیدها هـیچگونـه اپینـی را کـد نمـیکننـد. سـایر میکروارگانیـسم هـا (بـهجـز سـودومونادهای فلوروسنت، باکتریهای کـورنیم و قـارچهـای جـنس فـوزاریم و سـیلیندروکارپن( و سـلول هـای گیاهان قادر به مصرف اپینها نیستند. T-DNA همچنین کد کننده ژن های مربوط به آنزیم های دخیل در بیوسنتز هورمونهای اکسین و سیتوکینین است. بیوسنتز اکسین در اگروبـاکتریم از مـسیر  IAM و با واسطه آنزیمهای تریپتوفان مونواکسیژناز  و ایندول–۳استامید هیدرولاز  ( به ترتیـب کد شده توسط ژنهای iaaM و iaaH  ) صورت می گیرد. این آنزیم ها، تریپتوفان را در طـی دو مرحله به ایندول استیک اسید تبدیل می کنند (شکل۳ ) . مسیر IAM در گیاهـان وجـود نـدارد و در نتیجه گیاه قادر به تنظیم میزان تولید اکسین نبوده و آن را به طور دائم تولید میکند به طـوری که غلظت آن در گال به۱۰  برابر سلول های پیرامون آن می رسد.

T-DNA همچنین دارای ژنی بنام IPT است که کد کننده نوعی آنـزیم ایزوپنتیـل ترانـسفراز اســت کــه بــا کاتــالیز الحــاقAMP  بــه پــیش ســاز ایزوپرونوئیــدی آن (HMBDP)، بیوســنتز سیتوکینین را از کنترل سیستمهای تنظیم گر گیاه خارج مـیکنـد (شـکل ۴ ) . در نتیجـه، ژن ipt بـه طور دائم بیان و دائماً سیتوکینین تولید میشود و غلظت آن در گال به ۱۰۰ برابر سلولهـای عـادی میرسد. تولید مازاد و دائم هورمونهای رشد موجب افزایش تعداد و افـزایش انـدازه سـلولهـای تراریخته (هیپرپلازی و هیپرتروفی(  و تشکیل گال میشود.

کنترل
•    اقدامات زراعی
از گردوکاری در خاک های آلوده به A. tumefaciens پرهیز کنید. قبل از کشت می توان آلودگی خاک به این باکتری را توسط پی سی آر بررسی کرد. کاشت نهـال سـالم، حـذف نهـال های گال دار، کنترل نماتدها و حشرات تغذیـه کننـده از ریـشه، پرهیـز از ایجـاد زخـم در طوقـه در هنگام کاشت، خاکبرداری یا حمل وسایل در باغ و از صدمه زیاد به ریشه در هنگام جابجایی نهـال از موارد موثر در کنترل این بیماری اسـت. محافظـت ریـشه و طوقـه نهـال هنگـام غـرس بـا سـموم بیولوژیــک بــسیار مفیــد اســت امــا محافظــت توســط باکتریــسیدهای مــسی، هیپوکلریــت ســدیم و استرپتومایسین، نتیجه بخش نبوده است. هنگام بریدن پاجوش ها، ناحیه برش را با محلول %۵ سفید کننده خانگی ضد عفونی کنید و پاجوشها را بسوزانید.

•    مبارزه شیمیایی
در درختان بالغ، جراحی گـال هـای بـزرگ پرهزینـه و دشـوار اسـت و معمـولاً خـارج کـردن درخت اقتصادیتر است اما در درختان جوان (زیر ۳-۴ سال) یا گالهایی که کمتر از نیمی از دور طوقه را گرفته اند، نتیجه بخش است. جراحی باید در زمستان انجام شود و میتوان محل بـرش را بـا بکتیسین (حاوی ۲و-۴زایلنول و متاکسرول  ) تیمار کرد. این ماده فقط توسط بافت های سرطانی جذب میشود و تاثیری بر بافتهای سالم اطراف آن ندارد. ضد عفـونی خـاک بـاغ غیـر عملـی و غیر اقتصادی است. تدخین خاک خزانه گردو با مخلوط کلروپیکرین -متیل برومید موقتاً جمعیـت باکتری را می کاهد اماپس از اندکی، مجدداً بالا میرود.

•    استفاده از ارقام مقاوم
نتایج برنامه های غربالگری و مشاهدات باغی نشان داده است که میزان مقاومـت نـسبی ارقـام و پایه های مختلف گردو بـه ایـن بـاکتری متفـاوت اسـت ، هیبرید پارادوکس به شدت حساس و گردوی ایرانی و سیاه کالیفرنیای شمالی نیمه حـساس هـستند. در باغات گردوی کالیفرنیا در سال ۲۰۰۰، فراوانی گـال طوقـه در پایـه پـارادوکس %۳۰ و در پایـه گردوی سیاه کالیفرنیای شمالی فقط %۳ بود. با این وجود، به دلیل مقاومـت بـه نماتـد مولـد زخـم، فیتــوفترا، کمبــود روی، آبگرفتگــی و ســیل، هنــوز پــارادوکس پایــه انتخــابی بــسیاری از باغــداران کالیفرنیا است. از این رو محققین آمریکایی با انجام تلاقی هـایی بـین پـارادوکس (والـد پـدری) و گردوی سیاه کالیفرنیای شمالی، گردوی سیاه آریزونـا و گـردوی سـیاه شـرقی (والـد مـادری)، بـه هیبریدهای جدیدی دست یافته اند که میـزان مقاومـت آنهـا بـه گـال طوقـه معـادل گـردوی سـیاه کالیفرنیای شمالی است اخیراً. با استفاده از روشهای مهندسی ژنتیـک و خـاموش کـردن ژن iaaM  توانسته اند پایه های گردو و سیب مقاوم به گال طوقه ایجاد کنند .

•    کنترل بیولوژیک
کنترل بیولوژیک گال طوقه توسط سویه Kerr84 (K84) از باکتری A. radioacter بـا موفقیت انجام می شود. این سویه برای اولین بار در استرالیا از هلو جداسازی شد  و تولیدات تجاری آن به نامهای گالتروال-ا و نوبارک به طور گسترده ای در باغات تجاری و بـه خــصوص خزانــه درختــان میــوه هــسته دار (گــیلاس)، خــشک (بــادام) و رز بکــار بــرده مــیشــود. سویه K84 اثر محافظتی دارد و آغشتن آن به ریشه و طوقه نهال قبل از کاشـت موجـب پیـشگیری از تشکیل گال در چند میزبان از جمله گردو شده است. سویهK84  با اشـغال محـل زخـم و تولیـد آنتی بیوتیک اگروسین  ۸۴، سویه های نوع ناپولین یا ساکسیناموپین را مهار می کند ولی سویه های اکتوپین و اگروبین دار و گونه A. vitis (علیرغم نوع T-DNA ) بـه آن مقـاوم هـستند. بعـضی سویه های گالزا، ژن مقاومت به اگروسین را از سویهK84 گرفته و به اگروسین مقاوم شده انـد لـذا در ترکیبات جدید، از سویه K1026  که ژن مقاومـت بـه اگروسـین آن غیـر قابـل انتقـال بـه سـایر باکتریهاست، استفاده می شود. سویه Kl026 از طریـق مهندسـی ژنتیـک از سـویه K84 مـشتق شده و قادر به کنترل گال طوقه در بسیاری از درختان میوه از جمله خشکباری است.